羥自由基氧化對鰱魚肌原纖維蛋白結構的影響

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(1.華中農業大學食品科技學院,武漢 430070;2.國家大宗淡水魚加工技術研發分中心(武漢),武漢 430070)

魚糜制品是我國近幾年消費需求增長較快的水產加工品之一,2018年全國魚糜加工制品總產量達到145.55萬噸[1]。一般認為鱈魚等海水魚類是生產魚糜的優良原料,但由于海洋魚類資源日益匱乏,海水魚糜的供應逐年減少,淡水魚糜作為替代品逐漸受到企業的關注。鰱魚具有養殖量大、生產繁殖快、價格低、凝膠性能較好等特點,目前已成為淡水魚糜生產的主要原料。

在魚糜冷凍貯藏過程中,魚糜中的脂肪易發生氧化反應,產生多種活性氧自由基(例如羥自由基等),這些產物可引起魚肉蛋白發生氧化[2-3]。一般認為,活性氧自由基可攻擊蛋白質的氨基酸側鏈和肽鏈骨架,導致蛋白質分子發生裂解或者交聯[4]。蛋白質中的半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸殘基對活性氧自由基敏感[5-6],蛋白質氧化后其結構發生改變,進而影響蛋白的溶解性、乳化性、保水性和凝膠形成能力等功能特性[6-7]。目前已有學者對鯉魚、草魚、銀鯧、海鱸魚等魚類肌原纖維蛋白的活性氧自由基氧化所引起的結構變化開展了研究[8-11]。魚類肌原纖維蛋白的性質受魚種的影響較大,而目前缺乏對活性氧自由基氧化條件下鰱魚肌原纖維蛋白結構變化規律的認識。為此,本文以鰱魚肌原纖維蛋白為研究對象,利用芬頓體系產生不同濃度的羥自由基對蛋白進行模擬氧化,研究羥自由基氧化對肌原纖維蛋白結構的影響,以期為鰱魚糜品質變化提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix) 于春季購于華中農業大學農貿市場,體重1.5～2 kg;氯化鈉、氯化鐵、過氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、尿素、十二烷基磺酸鈉(SDS)、溴酚藍、考馬斯亮藍R-250、β-巰基乙醇、丙烯酰胺、N,N′-甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨(APS)等 均為分析純,購于國藥集團化學試劑有限公司。

AUY220分析天平、RF-5301熒光分光光度計 日本島津公司;722型分光光度計 上海舜宇恒平精密科學儀器有限公司;AVANTI J-26高速冷凍離心機 美國貝克曼公司;ZEN3600馬爾文激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司;Bio-Rad電泳儀 美國伯樂公司;Nicolet iS10 FTIR傅立葉變換紅外光譜儀 Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肌原纖維蛋白的提取 參考Lu等[12]方法,并做修改。從新鮮宰殺的白鰱背部采集魚肉,加入4倍體積的低鹽緩沖液(0.05 mol/L NaCl、3.38 mmol/L NaH2PO4、15.5 mmol/L Na2PO4、pH=7.5)混合，在高速均質機中于9000 r/min下均質2 min。在4 ℃下4000 r/min離心10 min,得到沉淀加入4倍體積的低鹽緩沖液,重復兩次。得到的沉淀加入4倍體積的高鹽緩沖液(0.45 mol/L NaCl、3.38 mmol/L NaH2PO4、15.5 mmol/L Na2PO4、pH=7.5),于4 ℃下靜置22 h,在4 ℃下12000 r/min離心10 min,將得到的上清液用10倍體積的蒸餾水沉淀30 min,將沉淀后的溶液用冷凍離心機在4 ℃下10000 r/min離心10 min,得到的沉淀即為肌原纖維蛋白,蛋白濃度用福林-酚比色法測定[13]。

1.2.2 羥自由基模擬氧化肌原纖維蛋白 用20 mmol/L的Tris-HCl(含0.6 mol/L NaCl,pH=7.2)將肌原蛋白稀釋為10 mg/mL,再用羥自由基產生體系(芬頓體系)(其中FeCl3、抗壞血酸的濃度均為0.1 mmol/L,H2O2濃度為:0、0.1、1、5、10和50 mmol/L)使肌原纖維蛋白氧化。4 ℃下反應24 h,空白對照組不加入H2O2。反應結束后加入0.02%的BHT終止氧化。

1.2.3 肌原纖維蛋白羰基含量的測定 參考Mesquita等[14]的方法,稍作變動。取4 mL肌原纖維蛋白溶液于試管中,向管中加入4 mL 10 mmol/L的DNPH,充分混合,室溫下靜置10 min,再加入2 mL濃度為6 mol/L的NaOH,于室溫環境下靜置10 min后,在450 nm波長條件下測定吸光值。以Tris-HCl緩沖溶液作空白對照,用朗伯比爾定律A=Kbc計算羰基含量，其中,消光系數K采用22308 mol-1·L·cm-1,b為吸收層厚度，即比色皿寬度1 cm,c為羰基含量濃度，單位表示為nmol/mg蛋白。

1.2.4 肌原纖維蛋白表面疏水性的測定 根據Chelh等[15]的方法,并加以修改。取5 mL肌原纖維蛋白溶液于離心管中,向其中加入1 mL的溴酚藍(BPB,1 mg/mL),振蕩10 min以充分混合均勻。離心20 min(4000 r/min)后取上清液1 mL,向其中加入9 mL的20 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(包括0.6 mol/L NaCl,pH7.2),混勻后使用可見光分光光度計在595 nm的條件下測定吸光值。空白為未加肌原纖維蛋白溶液的Tris-HCl緩沖溶液。用肌原纖維蛋白與溴酚藍的結合量來表示表面疏水性指數。計算公式如下:

式中:A空白為空白對照組的吸光值;A樣品為樣品組的吸光值。

1.2.5 肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的測定 參考Davies等[16]的方法,采用熒光分光光度計進行檢測,參數設定為:發射波長設為420 nm,激發波長設為325 nm,靈敏度為2,狹縫寬度均為5 nm,二聚酪氨酸的含量用相對熒光值(單位A.U)來表示,相對熒光值的計算公式如下:相對熒光值=吸光值/蛋白濃度。

1.2.6 肌原纖維蛋白巰基含量的測定 參考Ellman的方法[17],并做修改。活性巰基含量測定:將肌原纖維蛋白溶液調整為1 mg/mL,向其加入Ellman 試劑(0.1% DTNB,0.02 mol/L Tris-HCl,pH=6.8),肌原纖維蛋白溶液∶Ellman試劑=50∶1(v/v),混合均勻后將其放置于4 ℃下反應1 h,在412 nm波長下的吸光值為活性巰基的吸光度。總巰基含量測定:用0.02 mol/L的Tris-HCl(包括8 mol/L尿素、2% SDS、10 mmol/L EDTA,pH=6.8)將肌原纖維蛋白溶液(2.5 mg/mL)稀釋10倍,向其中加入1 mL Ellman試劑,40 ℃反應25 min,于412 nm處測定吸光值。巰基含量均采用朗伯比爾定律A=Kbc來計算。消光系數K為13600 mol-1·L·cm-1，b為吸收層厚度,即比色皿寬度為1 cm，c為巰基含量濃度，單位為nmol/mg蛋白。

1.2.7 肌原纖維蛋白內源熒光的測定 使用熒光分光光度計進行測定,得到發射光譜(310～450 nm)。參數設置為:激發波長280 nm,靈敏度2,狹縫寬度均為2.5 nm[10]。

1.2.8 肌原纖維蛋白粒徑分布的測定 參考Shimada等[18]的方法。將1 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液通過0.45 μm的醋酸纖維素微孔濾膜除去不溶性的顆粒。所得的溶液采用馬爾文激光粒度儀測定其粒徑分布。

1.2.9 肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖譜 參考Yin等[19]的方法,稍作修改。蛋白溶液分別和非還原性(不含β-巰基乙醇)及還原性(含β-巰基乙醇)上樣緩沖液體積比為1∶1混合,進樣體積為10 μL,濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度為12%。

1.2.10 肌原纖維蛋白二級結構的測定 參考Byler等[20]的方法,并做修改,用傅里葉紅外光譜測定。掃描參數:光譜范圍4000～400 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描累加64次,重復3次。利用OMNIC 8.2數據處理軟件對不同氧化程度的肌原纖維蛋白酰胺Ⅰ帶進行自動平滑、基線校正、傅里葉自去卷積,再用高斯進行擬合,得到各個峰的峰面積,算出蛋白質的二級結構。

1.2.11 肌原纖維蛋白氨基酸組成分析 參考《食品安全國家標準GB 5009.124-2016 食品中氨基酸的檢測》的方法[21]。

1.3 數據處理

除SDS-PAGE外,其他指標均設置三個重復,數據采用“平均值±標準差”表示,采用SAS 9.2分析軟件中的ANOVA程序進行顯著性分析,差異顯著性水平為P<0.05,數據繪圖采用Origin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 羥自由基氧化對肌原纖維蛋白羰基含量的影響

蛋白質中的羰基含量一般是反映蛋白質氧化程度重要指標之一。不同濃度的羥自由基對鰱魚肌原纖維蛋白羰基含量的影響如圖1所示。由圖1可知,當H2O2濃度在0～10 mmol/L時,隨著H2O2濃度的升高,蛋白質羰基含量顯著增加(P<0.05),當H2O2濃度達到10 mmol/L時,羰基含量相對于對照組增加了38.6%,這可能是由于羥自由基氧化氨基酸側鏈形成羰基,其中當氨基酸側鏈含有NH-或NH2-時更易被氧化成羰基[22]。當H2O2濃度達到10 mmol/L時,濃度繼續增加,羰基含量增加不顯著(P>0.05),可能是由于敏感性氨基酸側鏈基本都已被羥自由基氧化暴露。

圖1 羥自由基氧化對肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig.1 Effect of hydroxyl radical oxidation on carbonyl content of myofibrillar protein注:不同字母表示同一指標組間差異顯著(P<0.05)。圖2～圖4同。

2.2 羥自由基氧化對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

蛋白質的表面疏水性能夠反映蛋白表面疏水性氨基酸含量的相對含量,其變化能夠間接反映蛋白質的空間結構變化[23]。由圖2可知,肌原纖維蛋白表面疏水性隨著H2O2濃度的增加而逐漸增加,其中在H2O2濃度在0～1 mmol/L時顯著上升(P<0.05),當H2O2濃度為1 mol/L時,蛋白表面疏水性指數從空白對照組的47.66增加至91.28,增加了91.5%。這可能是由于蛋白氧化后,蛋白質分子發生伸展和去折疊,使蛋白質分子內部的芳香族氨基酸等疏水性基團暴露,造成蛋白質表面疏水性增加[24]。當H2O2濃度在1～50 mmol/L時,隨著H2O2濃度的增加,相鄰兩組間表面疏水性指數變化不顯著(P>0.05),這可能是由于暴露的疏水性基團進一步被氧化形成親水性基團,從而使表面疏水性指數降低,另外氨基酸之間的疏水相互作用和氧化所引起的蛋白質分子間的交聯可促使蛋白質發生聚集,從而屏蔽去折疊的效應[8,24],進而導致在高濃度H2O2時肌原纖維蛋白表面疏水性指數變化不顯著。

圖2 羥自由基氧化對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effect of hydroxyl radical oxidation on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

2.3 羥自由基氧化對肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響

二聚酪氨酸是蛋白質的酪氨酸殘基被氧化,通過共價鍵和非共價鍵作用形成的蛋白質聚集體,蛋白質中的二聚酪氨酸含量一定程度上能夠反映蛋白質的氧化程度[2,4]。由圖3可知,H2O2濃度低于10 mmol/L時,隨著H2O2濃度的增加,二聚酪氨酸的含量顯著增加(P<0.05),說明酪氨酸殘基對羥自由基較敏感。陳霞霞等[9]在研究羥自由基模擬氧化銀鯧肌原纖維蛋白也有類似結果。當H2O2濃度達到50 mmol/L的時,二聚酪氨酸含量反而顯著下降(P<0.05),這可能是因為一方面酪氨酸殘基基本被羥自由基氧化完全,另一方面高濃度H2O2可使蛋白質分子發生交聯和聚集,導致被埋在蛋白質分子內部的二聚酪氨酸無法被檢測出來[4]。

圖3 羥自由基氧化對肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響Fig.3 Effect of hydroxyl radical oxidation on di-tyrosine content of myofibrillar protein

2.4 羥自由基氧化對肌原纖維蛋白巰基含量的影響

由于半胱氨酸的巰基基團易被氧化形成二硫鍵,故巰基含量能夠在一定程度反應蛋白氧化程度[4,10]。不同氧化程度的鰱魚肌原纖維蛋白巰基含量的變化如圖4所示。由圖4可知,當H2O2濃度達到1 mmol/L時,隨著H2O2濃度的繼續增加,總巰基含量開始顯著下降(P<0.05),當H2O2濃度達到50 mmol/L時總巰基含量由對照組的45.76 nmol/mg下降至35.49 nmol/mg,活性巰基含量整體來說也呈下降趨勢,這可能是由于羥自由基氧化半胱氨酸等含硫氨基酸殘基，使蛋白質分子內或分子間形成二硫鍵,另外羥自由基含量過高能夠將其進一步氧化成磺酸類或其他產物[25]。在H2O2濃度由0.1 mmol/L增加到1 mmol/L時,活性巰基含量有略微上升,這可能是由于氧化使蛋白質分子展開時,一些內部的巰基基團暴露出來,使得活性巰基增加[26-27],這與前文所述的羥自由基氧化對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響(見圖2)相一致。

圖4 羥自由基氧化對肌原纖維蛋白巰基含量的影響Fig.4 Effects of hydroxyl radical oxidation on sulfhydryl groups content of myofibrillar protein

2.5 羥自由基氧化對肌原纖維蛋白內源熒光的影響

蛋白質中一些生色氨基酸如色氨酸、酪氨酸對羥自由基氧化較為敏感,測定蛋白質的內源熒光強度,可反映出蛋白質分子中色氨酸等熒光基團的氧化程度及其所處環境的情況,進一步評價蛋白質結構和構象的變化[2,4,10]。羥自由基氧化對肌原纖維蛋白內源熒光的影響如圖5所示,熒光強度隨著H2O2濃度的增大而逐漸降低;其中內源熒光在H2O2濃度0～1 mmol/L和10～50 mmol/L顯著下降(P<0.05)。內源熒光在H2O2濃度0～1 mmol/L顯著下降(P<0.05),這可能是由于色氨酸等熒光基團對羥自由基敏感,被氧化形成的基團沒有或具有較弱的熒光特性。內源熒光在H2O2濃度10～50 mmol/L顯著下降(P<0.05),可能是蛋白質氧化聚集導致色氨酸等生色氨基酸殘基被包埋[28],另外羥自由基濃度過高會對生色氨基酸產生猝滅作用[29]。

2.6 羥自由基氧化對肌原纖維蛋白粒徑分布的影響

粒徑分布情況在一定程度上可以反映處肌原纖維蛋白的聚集程度,不同氧化程度的肌原纖維蛋白的粒徑分布如圖6所示。由圖6可知,對照組到達峰頂的粒徑為231.3 nm,隨著H2O2濃度的增加,肌原纖維蛋白的粒徑分布向粒度大方向偏移,且濃度越大,偏移程度越大,當H2O2濃度增至50 mmol/L時,到達峰頂的粒徑達到382.3 nm,與對照組相比增加了65.28%。這可能由于氧化導致肌原纖維蛋白發生聚集,使肌原纖維蛋白平均粒徑變大。Wang等[25]和Wu等[28]研究發現,羥自由基也能夠使蛋清粉和大豆蛋白發生聚集,平均粒徑增大,與本文結果一致。

圖6 不同氧化程度肌原纖維蛋白的粒徑分布Fig.6 Particle size distribution of myofibrillar protein oxidized by hydroxyl radical

2.7 羥自由基氧化對肌原纖維蛋白SDS-PAGE的影響

表1 羥自由基氧化對肌原纖維蛋白二級結構的影響(%)Table 1 Effects of hydroxyl radical oxidation on myofibrillar protein secondary structure(%)

SDS-PAGE電泳圖能夠反映蛋白質之間的交聯、聚集及其降解情況。β-巰基乙醇是一種還原劑,在SDS-PAGE電泳中能夠打斷二硫鍵。由圖7(a)與圖7(b)肌球蛋白重鏈條帶強度差異明顯可知,氧化導致蛋白質分子間形成了二硫鍵,同時圖4中總巰基含量比活性巰基下降少也說明氧化形成了二硫鍵。在非還原性電泳圖(圖7a)中,當H2O2濃度為5 mmol/L時,肌球蛋白重鏈條帶變淺。這可能是由于羥自由基氧化肌原纖維蛋白并不是首先氧化巰基使分子間形成二硫鍵,而是氧化蛋白其他基團或者氧化巰基形成分子內二硫鍵[30]。在加入β-巰基乙醇后(圖7b),分離膠頂端聚合物條帶和進樣孔處電泳條帶減弱,而肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、原肌動蛋白條帶明顯加重,說明氧化使肌原纖維蛋白分子之間交聯或聚集,形成了分子量較大且不可溶的聚集體,同時也說明了二硫鍵是主要的交聯的方式。在還原性電泳圖中(圖7b),分離膠頂端也有少量聚集體,說明還有某些蛋白聚集體的交聯方式是其他方式,像Tyr-Tyr、羰基和氨基的共價交聯也能形成蛋白聚集體等[31],同時圖3中二聚酪氨酸含量的增加也表明了Tyr-Tyr共價交聯形成的蛋白聚集體的存在。

圖7 不同氧化程度肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.7 SDS-PAGE patterns of myofibrillar protein oxidized by hydroxyl radical

2.8 羥自由基氧化對肌原纖維蛋白二級結構的影響

蛋白質的二級結構主要是通過骨架上的羰基和酰胺基團之間形成的氫鍵維持的,氫鍵是穩定二級結構的主要作用力,其主要由四種構象組成:α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲。通過對蛋白質在紅外光譜的吸收變化可以反映出蛋白質的二級結構變化,其中酰胺Ⅰ帶(1600～1700 cm-1)是研究蛋白質二級結構最有價值的。在這個波段內,1600～1640 cm-1為β-折疊的吸收波段,1640～1650 cm-1為無規卷曲的吸收波段,1650～1658 cm-1為α-螺旋的吸收波段,1660～1695 cm-1為β-轉角的吸收波段[12,32]。

表1是羥自由基氧化對肌原纖維蛋白二級結構的影響,由表1可知,隨著H2O2濃度的增加,α-螺旋的相對百分含量先呈下降趨勢,當H2O2濃度達到1 mmol/L后變化不再顯著(P>0.05);β-折疊的相對百分含量呈先上升后下降的趨勢,當H2O2濃度為1 mmol/L時達到最大值;與對照組(H2O2濃度為0 mmol/L)相比,H2O2濃度對β-轉角相對百分含量變化的影響不顯著(P>0.05);濃度0～10 mmol/L的H2O2對無規卷曲的相對百分含量影響不顯著(P>0.05),但與對照組相比,濃度為50 mmol/L的H2O2可使無規卷曲的相對百分含量顯著增加(P<0.05)。在低濃度的H2O2(0～1 mmol/L)下,α-螺旋相對百分含量的降低、β-折疊相對百分含量的增加一方面可能是由于氧化導致蛋白分子的伸展、折疊,破壞了α-螺旋的穩定結構,并且形成了β-折疊結構[33]。在H2O2濃度大于1 mmol/L時,β-折疊相對百分含量的降低和無規卷曲相對百分含量的增加,可能是由于高濃度的羥自由基導致肌原纖維蛋白的肽鏈發生裂解,蛋白結構發生改變,導致穩定的β-折疊向不穩定的無規卷曲轉化[32]。

2.9 羥自由基氧化對肌原纖維蛋白氨基酸組成的影響

不同氧化程度的肌原纖維蛋白氨基酸組成如表2所示。H2O2濃度為0、0.1、1、5、10和50 mmol/L時,肌原纖維蛋白氨基酸總含量分別為735.73±11.57、715.26±14.57、707.12±8.96、659.82±3.92、647.68±0.48和644.82±3.37 mg/100 g。隨著氧化程度升高,氨基酸總含量呈下降的趨勢,其中當H2O2濃度1 mol/L增加至5 mmol/L時,氨基酸總含量發生顯著下降(P<0.05);當H2O2濃度高于5 mmol/L,氨基酸總含量下降不顯著(P>0.05)。

表2 羥自由基氧化肌原纖維蛋白氨基酸組成的比較Table 2 Comparison of amino acid composition among myofibrillar protein oxidized by hydroxyl radical

由表2可知,從氨基酸組成來看,隨著氧化程度的增加,檢測出的18種氨基酸含量都出現不同程度的降低,說明氧化過程基本所有氨基酸都會參與反應。精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)含量會隨著氧化程度的提高而降低,Arg和Lys因含有NH2基團易被氧化形成羰基,故Arg和Lys含量的降低與蛋白羰基含量升高相一致(見圖1);半胱氨酸(Cys)是一種含有巰基的氨基酸,其含量降低與蛋白巰基含量下降相一致(見圖4);酪氨酸(Tyr)含量的降低與二聚酪氨酸含量增加相一致(見圖3);色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)含量的降低與蛋白內源熒光下降相一致(見圖5)。H2O2濃度為50 mmol/L時的丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、賴氨酸(Lys)和酪氨酸(Tyr)相對于空白對組的減少量為16.96%、20.98%、14.78%和14.01%,用此來表示氨基酸對羥自由基的敏感程度,則敏感程度為Cys>Ala>Lys>Tyr。

3 結論

鰱魚肌原纖維蛋白經羥自由基氧化后,其結構發生明顯改變,并存在明顯的量效關系。隨著H2O2濃度的增加,蛋白質羰基含量、表面疏水性和蛋白質粒徑增加,二聚酪氨酸含量先增加后減少,總巰基含量、活性巰基含量和內源熒光強度下降。SDS-PAGE電泳圖譜顯示,羥自由基氧化可使蛋白發生交聯和聚集,主要以二硫鍵形式形成高分子量聚集體。氧化可使肌原纖維蛋白二級結構也會發生改變,低濃度氧化劑可促進α-螺旋向β-折疊轉化,而高濃度氧化劑則促進β-折疊向無規卷曲轉化。羥自由基能夠氧化肌原纖維蛋白的絕大部分氨基酸,敏感程度為Cys>Ala>Lys>Tyr。鰱魚肌原纖維蛋白結構的改變會影響其功能特性,因此在鰱魚加工和貯藏過程中應采取措施防止肌原纖維蛋白發生氧化,盡量減少由于氧化引起的魚肉加工性能和營養品質的劣變。