一株丹參種子內生真菌ZJZD3的分離鑒定及其生物活性

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(1.山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)生命科學學院,山東泰安 271016;2.山東大學藥學院,山東濟南 250012;3.山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)藥學院,山東泰安 271016)

丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)是雙子葉植物唇形科鼠尾草屬多年生直立草本植物,分布于中國安徽、河北、四川、江蘇等地。除此之外,山西、山東、遼寧、甘肅等地也有分布。丹參主要含有脂溶性的二萜類成分和水溶性的丹酚酸成分,還含有黃酮類,三萜類,甾醇等其他成分[1-2],具有抗菌消炎、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤等活性[3-6],是目前治療心腦血管疾病的核心藥物。

近年來,藥用植物內生菌作為一類新的微生物資源備受人們關注。內生菌(Endophytes)是指在其生活史的部分階段或全部階段中,生活在健康植物各個組織和器官內部或細胞間隙,并且對活體植物組織能夠造成不明顯或無癥狀影響,其中包括內生真菌、內生放線菌、內生細菌[7]。內生菌長期生活在植物體內的特殊環境中,與宿主植物協同進化,能產生與宿主相同或相似的化學成分[7],具有抗菌、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤[1,4,6]、促進植物生長[8-10],提高宿主植物的抗病能力[11-13]等功能。

因此,本文擬采用純培養及生物學活性評價等方法,從丹參種子中分離內生菌,篩選具有抗菌、抗氧化和抗凝血活性的內生菌并進行分子鑒定,旨在為天然活性成分開發提供新的資源,并為丹參種子萌發以及丹參中藥材的物種保護奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白花丹參(SalviamiltiorrhizaBge.f.alba)和紫花丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)兩種種子 2017年8月采自山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)藥用植物園;丹參病原菌1、病原菌4和病原菌6 由山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)李艷玲老師分離并提供;新西蘭大白兔 由山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)實驗動物中心提供;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)[14]自行配制,用于分離內生真菌;馬鈴薯葡萄糖培養基(PD)[14]自行配制,用于真菌的液體發酵;牛肉膏蛋白胨固體培養基[14]自行配制,用于分離內生細菌;牛肉膏蛋白胨液體培養基[14]自行配制,用于細菌的液體發酵;高氏1號培養基[14]自行配制,用于分離放線菌;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) Sigma公司;凝血酶原時間(PT)測定試劑盒、活化部分凝血酶時間(APTT)測定試劑盒、凝血酶時間(TT)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;檸檬酸鈉 天津市巴斯夫化工有限公司;肝素 Solarbio公司。

OLYMPUS CX31光學顯微鏡 日本東京奧林巴斯;SW-CJ-2F型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;YX280A 手提式數字高壓滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司;BS-2F數顯振蕩培養箱 上海梅香儀器有限公司;ICYCLER PCR儀 美國伯樂。

1.2 實驗方法

1.2.1 丹參種子內生菌的分離純化 隨機挑選無霉變、飽滿和無蟲咬的白花丹參種子和紫花丹參種子各150粒,先將其在蒸餾水中浸泡過夜,清洗后晾干。按照下列方法[15]進行表面消毒:用75%的酒精浸泡兩種種子30 s,再在3%的次氯酸鈉溶液中浸泡5 min左右,后在75%酒精中浸泡1 min,用無菌水沖洗3～5次,每次3 min左右,用濾紙將種子表面液體吸干。用滅菌的解剖刀將兩種丹參種子切開,分別接于PDA培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、高氏1號培養基上,每種培養基設置10個平板(白花種子和紫花種子各設置5個平板)且每個平板均放置10粒處理過的種子,分別置于28、37、28 ℃的培養箱中黑暗培養。培養5～7 d之后,用接種針挑取種子周圍長勢較好的菌接至新的固體培養基上,待新接種的內生菌長成菌落后,再挑取其邊緣的內生菌進行培養,如此反復3～4次后得到純化的菌株,保存備用。將得到的純化菌株進行編號并4 ℃冰箱保藏。

1.2.2 內生菌的形態學鑒定 通過直接觀察菌落大小、顏色、質地、邊緣、滲出物等對菌落形態進行描述。用牙簽挑取少量菌落置于中央滴有清水的載玻片上,蓋上蓋玻片,置于顯微鏡下觀察真菌孢子結構。

1.2.3 內生菌菌株的液體培養及發酵液處理

1.2.3.1 真菌的液體發酵 用打孔器從PDA培養基上取直徑為0.6 cm的內生真菌菌塊,接種于滅菌后的75 mL液體培養基中,28 ℃搖床振蕩培養5～7 d。發酵液以8000 r/min離心5 min,取上清液,備用。

1.2.3.2 細菌的液體發酵 用接種環挑取細菌單菌落于牛肉膏蛋白胨液體培養基中,37 ℃搖床200 r/min振蕩培養24 h。發酵液以8000 r/min離心5 min,取上清液,備用。

1.2.4 內生菌對丹參病原菌的抑菌活性測定

1.2.4.1 內生真菌對丹參病原菌的抑菌活性測定 平板對峙法測定內生真菌的抗丹參病原菌活性[15-16]。用打孔器分別取直徑0.6 cm的三種病原菌以及內生真菌菌塊,置于滅菌的PDA培養基距培養皿邊緣距離2 cm處,以只接病原真菌的平板作為對照,處理和對照均設3次重復,置于25 ℃下恒溫培養5～7 d。然后,測量對峙拮抗帶寬度的直徑大小,以拮抗帶寬度直徑大小衡量分離內生真菌抑菌效果的強弱。

十字交叉法測定內生真菌發酵液對丹參病原菌的抑菌活性[17]。將發酵液抽濾,8000 r/min、4 ℃離心5 min后,取上清液與培養基按體積比1∶2的比例混合均勻,倒入無菌的平板中,配制成帶毒培養基[18]。待培養基凝固后在平板的中央接一塊丹參枯萎病病原菌菌餅,并設置對照組,在不帶毒的PDA培養基平板中央同樣接一塊病原菌,每個處理3個重復,28 ℃恒溫培養4 d。觀察病原菌的生長狀態,并測量出實驗組和對照組病原菌菌落直徑,通過十字交叉法[17]計算抑菌率,評估丹參內生真菌發酵液對丹參病原菌的抑制效果。

抑菌率(%)=(對照組菌落直徑-實驗組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100

1.2.4.2 內生細菌對丹參病原菌的抑菌活性測定 采用濾紙片法[19],選擇具有抑菌活性的菌株,進一步研究其次級代謝產物的抑菌活性。將內生菌發酵液的上清液置于滅菌的離心管中,然后放入直徑為0.6 cm的濾滅菌紙片浸泡30 min;用打孔器打孔,取直徑為0.6 cm的三種病原菌分別置于滅菌的PDA培養基中,使其距離平板邊緣2 cm,將浸泡過的濾紙片同樣距離平板邊緣2 cm放置于帶有病原菌的PDA培養基中,重復3次。以只接病原真菌的平板作為對照,處理和對照均設3次重復,置于25 ℃下恒溫培養5～7 d,測定對照病原菌和處理病原菌的直徑,計算抑菌率。

1.2.5 內生菌的抗氧化活性測定 采用DPPH法[15]測定丹參內生菌的抗氧化活性。用無水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液,避光保存。內生菌濾液用旋轉蒸發儀,真空度1.35×107Pa,溫度-45 ℃減壓蒸發濃縮至膏狀,加入3倍體積的95%乙醇振蕩提取2次,真空干燥得粗提物,用無水乙醇配成0.5 mg/mL的溶液。VC為陽性對照,也配成相同的濃度。將1 mL內生菌粗提液及3 mL DPPH溶液加入同一離心管中,搖勻,室溫下靜置30 min,測定吸光度為As。將3 mL DPPH溶液與1 mL蒸餾水加入同一試管中,搖勻,室溫下靜置30 min,測定吸光度為Ac。將1 mL內生菌粗提液與3 mL無水乙醇加入同一離心管中,搖勻,室溫下靜置30 min,測定吸光度為Ab。每個測試樣品重復三次,計算每個測試樣品的清除率。清除率計算公式如下:

1.2.6 內生菌的抗凝血活性測定

1.2.6.1 兔耳緣靜脈取血 將兔放入僅露出頭部及兩耳的固定盒中,選擇耳靜脈清晰的耳朵,將耳靜脈部位的毛拔去,用75%酒精局部消毒,待干。然后用手指輕輕摩擦兔耳,使其靜脈擴張,耳緣靜脈取血,取血完畢用棉球壓迫止血。

1.2.6.2 抗凝血活性測定 將內生菌發酵液上清冷凍干燥,用0.9%生理鹽水∶甲醇(7∶3)作為溶劑,制備10 mg/mL的溶液。按照本實驗室建立的抗凝血活性測定方法[20]。每組準備四支試管,分別編號甲、乙、丙、丁,甲試管加入(0.9%生理鹽水)1 mL為空白對照;乙試管加入0.2%肝素鈉1 mL;丙、丁各加入1 mL內生菌提取液。從家兔耳緣靜脈或兔耳中央動脈采血4 mL,自血液進入注射器開始計時,三支試管各加1 mL血樣,充分振搖后,將這些試管放入37 ℃的水浴鍋中。每隔30 s傾斜試管一次,觀察三支試管的血液凝固情況,直至將試管倒置血液不流動為止,取平均值。以0.9%的氯化鈉溶液為空白對照,以0.2%肝素為陽性對照,重復操作三次,測定內生菌對兔凝血時間(CT)的影響。并按照方法[20]測定內生菌發酵液對兔凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)以及活性部分凝血酶時間(APTT)的影響。

1.2.7 抗菌、抗氧化、抗凝血內生真菌的分子鑒定 篩選具有抗菌、抗氧化、抗凝血作用的菌株,采用改良SDS法提取基因組DNA,通過通用引物對ITS1/ITS4進行PCR擴增:ITS1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)和ITS4(5′-TCC TCCGCT TAT TGA TAT GC-3′)[15,21]。反應結束后取5 μL PCR產物,通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR反應產物純化后,送到上海鉑尚生物科技有限公司測序后,將其序列與GenBank數據庫中已登陸的序列進行Blast比對,搜索同源序列。采用MEGA 4.0軟件Clustal X 1.81方法構建系統發育樹。

1.3 數據處理

用SPSS 19.0軟件進行數據分析,所有實驗均重復3次,結果采用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 丹參種子內生菌分離純化及培養特征觀察

從50粒紫花種子中分離出9株真菌、9株細菌;從50粒白花種子中分離出11株真菌、2株細菌(表1)。分離的內生真菌和內生細菌種類較少,主要是分離方法、消毒方法和培養基影響了分離結果[22-23],可考慮優化培養基種類和消毒時間提高分離率。

表1 兩種丹參種子內生菌的分離率Table 1 Isolation rate of endophytes from two species of Salvia miltiorrhiza seeds

將丹參種子內生菌轉接于固體培養基上,繼續純化培養,內生真菌和內生細菌的菌落形態描述,見表2和表3。根據顯微鏡下對菌落形態、顏色的觀察,可初步對純化的內生真菌和內生細菌進行種屬的劃分。

表2 丹參種子內生真菌的菌落特征Table 2 Colony characteristics of endophytic fungi from two species of Salvia miltiorrhiza seeds

2.2 內生菌對丹參病原菌的抑菌活性測定

2.2.1 平板對峙法測定內生真菌對丹參病原菌的抑菌作用 采用平板對峙法進行初步篩選,每天觀察抑菌情況,發現只有一株內生真菌ZJZD-3對病原菌4和6有較好抑菌效果。將產生抑菌活性的內生真菌ZJZD-3重新與丹參病原菌進行平板對峙,通過測量對照病原菌和處理病原菌的直徑,計算內生真菌ZJZD-3的抑菌率。從圖1,表4可看出,內生真菌ZJZD-3對兩種病原菌均有抑菌效果,其中對病原菌4的抑菌作用較強,抑菌率為41.36%±0.34%,對病原菌6的抑菌作用較弱,抑菌率為34.13%±0.19%,原因主要是兩種病原菌產生的毒性物質不同導致抑菌效果有所差異。

圖1 內生真菌ZJZD-3對丹參病原菌的抑菌Fig.1 Antimicrobial effects of endophytic fungus ZJZD-3 on pathogenic fungi

表4 內生真菌ZJZD-3對病原菌的抑菌作用(n=3)Table 4 Antimicrobial effects of endophytic fungus ZJZD-3 on pathogenic fungi(n=3)

2.2.2 十字交叉法測定內生真菌對丹參病原菌的抑菌作用 采用十字交叉法測定內生真菌對丹參病原菌的抑菌活性,結果表明,測試的20株內生真菌,同樣只有內生真菌ZJZD-3對病原菌4和6具有明顯抑菌能力。由圖2可知,與對照組相比,丹參病原菌4和6在一定程度上均被抑制,經計算抑制率分別為70.1%和59.6%,抑制率較菌-菌對峙實驗提高,暗示著內生真菌ZJZD-3發酵液中含有能抑制病原菌生長的代謝產物,可大大提高丹參病原菌的抑菌效果。

圖2 內生真菌ZJZD-3發酵液對丹參病原菌的抑制Fig.2 Antimicrobial effects of endophytic fungus ZJZD-3 fermentation liquid on pathogenic fungi注:a.病原菌4;b.病原菌6;c. ZJZD-3-病原菌4;d. ZJZD-3-病原菌6。

2.2.3 內生細菌對丹參病原菌的抑菌作用 采用濾紙片法,測定分離的11株內生細菌對丹參病原菌的抑菌作用,結果表明,分離的內生細菌對三種病原菌基本無抑菌作用,原因可能是分離的內生細菌不能產生抑制病原菌生長的代謝產物。

2.3 內生菌的抗氧化活性測定

內生菌乙醇粗提液(0.5 mg/mL)的抗氧化能力結果,如表5所示。結果表明,陽性對照VC對DPPH的清除率為96.33%±1.68%;內生真菌中,內生真菌ZJZD-3對DPPH的清除率最高,為91.44%±3.13%,可能含有與宿主相同或相似的抗氧化活性物質;其次是ZJZD-1、ZJZD-5抗氧化能力較強,而ZJBD-1的清除率最低,抗氧化能力最弱。內生細菌中,菌株XJBD-2的清除率最高為86.72%±3.64%;其次為XJBD-1,清除率為85.21%±2.34%。

表5 丹參種子內生菌對DPPH·的清除率Table 5 DPPH· clearance rates of endophytes from Salvia miltiorrhiza seeds

2.4 內生菌的抗凝血活性測定

2.4.1 內生菌對家兔的抗凝血作用 經檢測,加入內生細菌發酵液上清的試管血液全部凝集,沒有抗凝血能力。內生真菌中,只有內生真菌ZJZD-3具有較強的抗凝血能力。因此,接下來對內生真菌ZJZD-3對家兔凝血時間(CT)、凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)以及活性部分凝血酶時間(APTT)的影響進行深入研究。

2.4.2 內生真菌ZJZD-3對家兔凝血時間(CT)的影響 實驗結果發現，沒有添加任何抗凝劑的空白對照在357.5 s左右即凝固;陽性對照組樣品不凝;內生真菌ZJZD-3發酵液不凝,與陽性對照組效果相同。

2.4.3 內生真菌ZJZD-3對家兔凝血酶時間(TT)的影響 內生真菌ZJZD-3對家兔TT的影響結果見表6。從表中可以看出,空白對照在27.58 s時出現纖維蛋白絲,加入肝素鈉的陽性對照樣品不凝;加入內生真菌ZJZD-3發酵液對家兔TT有極顯著延長作用(P<0.01)。

表6 內生真菌ZJZD-3對家兔TT的影響Table 6 Effect of endophytic fungus ZJZD-3 on thrombin time

2.4.4 內生真菌ZJZD-3對家兔凝血酶原時間(PT)的影響 內生真菌ZJZD-3對家兔PT的影響結果見表7。從表中可以看出,陰性對照在21 s時出現纖維蛋白絲,加入肝素鈉的陽性對照樣品不凝,加入內生真菌ZJZD-3發酵液對家兔PT沒有顯著延長作用(P>0.05)。

表7 內生真菌ZJZD-3對家兔PT的影響Table 7 Effect of endophytic fungus ZJZD-3 on prothrombin time

2.4.5 內生真菌ZJZD-3對家兔活性部分凝血酶時間(APTT)的影響 內生真菌ZJZD-3對家兔APTT的影響結果見表8。從表8中可以看出,陰性對照在140.9 s時出現纖維蛋白絲,加入肝素鈉的陽性對照樣品不凝;加入內生真菌ZJZD-3發酵液可極顯著延長家兔APTT(P<0.01)。

圖3 根據rDNA-ITS 序列分析構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of endophytic fungus ZJZD-3 strain

表8 內生真菌ZJZD-3對家兔APTT的影響Table 8 Effect of endophytic fungus ZJZD-3 on activated partial thromboplastin time

2.5 內生真菌ZJZD-3的分子鑒定

將測序的內生真菌ZJZD-3的ITS序列在GenBank數據庫中進行Blast比對,選擇相似度>97%的序列進行分子系統發育關系分析(圖3)。結果發現,內生真菌ZJZD-3與來自GenBank中的Talaromycesgossypii(NR_147423.1)和T.trachyspermus(NR_147425.1)聚在一起形成了一個分支。經過分子鑒定結果并結合形態學鑒定,內生真菌ZJZD-3被確定為籃狀菌屬。

3 結論與討論

內生真菌在植物體內普遍存在,但從不同植物體內分離到的內生真菌種類和數量具有很大的差異,主要與取樣策略、培養條件以及氣候環境等有關[23]。本研究從丹參種子中分離出20株內生真菌和11株內生細菌,分離出的內生真菌和細菌種類較少,今后需進一步改進分離方法提高內生菌的分離率。

本實驗從丹參種子中分離出一株具有抗菌、抗氧化、抗凝血活性的內生真菌ZJZD-3,具有與宿主丹參相似的功能,推測ZJZD-3在代謝過程中能產生與宿主相同或相似的成分,這部分工作課題組正在進一步研究。ZJZD-3的抗菌抗氧化檢測結果與李艷玲等[15,21]研究結果一致,抗凝血活性與文獻[21]研究結果相似。該內生真菌ZJZD-3菌株可以有效地抑制丹參病原菌的生長,利用這一性質,可以對丹參種子的萌發做進一步研究。近年來,微生物對種子萌發的影響已有許多研究報道,何鐵柱等[24]研究發現,根際微生物有利于提高白菜種子的發芽率及發芽勢;高小寬等[25]研究發現,根際微生物可明顯促進種子的萌發,提高種子發芽率和發芽勢;李紹鋒[26]研究發現豚草種帶內生真菌可以促進種子發芽和幼苗生長。因此,課題組今后將進一步研究內生菌對丹參種子萌發的影響以及抗病促生機制,為丹參的優質高產栽培奠定基礎。