不同醇沉竹蓀多糖組分對青春雙歧桿菌體外增殖作用的影響

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(1.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002;2.福建林業職業技術學院,福建南平 353000;3.福建省特種淀粉品質科學與加工技術重點實驗室,福建福州 350002;4.中愛國際合作食品物質學與結構設計研究中心,福建福州 350002)

竹蓀(Dictyophoraindusiata(Vent.Pers.)Fisch.)是一種產于亞洲熱帶地區的珍稀食、藥兩用菌,在古代被列為“宮廷貢品”[1]。其含有人體所必需的8種氨基酸,同時富含多糖、蛋白質、脂肪等多種營養成分;其所含的多糖是具有高活性的大分子物質,在抗腫瘤[2]、抗凝血[3]以及免疫調節[4]等方面都有一定的療效。且竹蓀多糖(DPs)是竹蓀中的主要活性成分之一,具有很高的開發及利用價值。竹蓀中大部分的多糖位于細胞內,因此為將其從含有其他物質的細胞內提取出來,通常需要采用破壁、脫脂、溶劑提取這三個過程。有研究表明,乙醇溶液可分離幾乎所有的多糖,其中乙醇濃度對分離產生著重要的影響,濃度過低(沉淀不完全)或者過高(易產生漿狀,不易操作)都不利于多糖分級純化的進行[5]。

益生元通常是由非消化性的食物成分組成,通過選擇性地刺激機體內的益生菌生長進而對宿主產生益生作用[6-7]。Bindels等[8]在2015年對益生元的定義進行了修正并最終定義為:非消化性成分,通過腸道微生物代謝調節腸道微生物組成或活力,從而對宿主產生有益的生理影響。根據最新的定義,在明確已有益生元種類的基礎上,提出了將抗性淀粉、阿拉伯木聚糖、膳食纖維以及其他非消化性的碳水化合物作為益生元的候選者,進一步擴大了益生元的研究范疇,豐富了益生元的內涵和范疇[9-10]。與此同時,自然界中廣泛存在非淀粉類多糖,是植物和真菌細胞壁的主要成分,近年來,有關非淀粉類天然多糖的生物學活性已經被廣泛研究和臨床應用[11]。然而,有關非淀粉類多糖的益生元功效的報道仍然較少。竹蓀多糖是竹蓀子實體的結構性物質,其中多糖含量豐富,竹蓀多糖由β-葡聚糖、β-半乳葡甘聚糖等組分組成[12-17],目前還未見有關其益生元活性的相關報道。

有研究表明,纖維素、淀粉等大分子量的碳水化物在不同乙醇濃度下的沉淀物具有不同的理化性質[18-21],主要表現在分子量、特定單糖組分含量、表觀粘度等方面。耿安靜等[22]以香菇精多糖為原料,發現醇沉體積分數和方式對香菇多糖得率和分子質量分布均有較大影響。Xue等[18]以半纖維素進行分級醇沉,結果顯示低乙醇濃度的沉淀組分的平均分子量較高,高濃度乙醇沉淀的多為小分子多糖和低聚糖;表明醇沉產物的分子量與乙醇濃度存在相關性。雙歧桿菌是能夠廣泛存在于人和動物腸道內的專性厭氧性細菌,它與宿主的健康狀況密切相關[23-24]。隨著微生態學的崛起和快速發展,雙歧桿菌的各種生物學功能已經被發現并且應用于各個領域。雙歧桿菌對營養的要求較高并且生長緩慢[25],如何有效地促進該菌的增殖一直是研究的熱點性問題。因此,本文在竹蓀多糖分級醇沉的基礎上,通過青春雙歧桿菌體外增殖試驗,評價竹蓀多糖及其分級醇沉組分的益生元功效,為豐富益生元的種類提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長裙竹蓀 南平勝利市場采購;竹蓀分級醇沉多糖 自行制備;菊粉 比利時Cosucra公司;厭氧培養盒、厭氧產氣袋 日本三菱公司;α-淀粉酶、L-半胱氨酸、酵母粉、胰蛋白胨 Sigma有限公司;正丁醇、三氯甲烷、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇、葡萄糖、大豆蛋白胨 國藥集團化學試劑有限公司;MgSO4·7H2O、NaOH、NaCl、KOH、NaHCO3、CaCl2、K2HPO4上海化學試劑廠。

XH-300B型超聲波-微波組合反應系統 北京祥鵠科技發展有限公司;KQ-300E超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;FZ102植物粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;L530型低速離心機 長沙高新技術產業湘儀離心機儀器有限公司;LG-1.0型真空冷凍干燥機 新陽速凍設備制造有限公司;AL104型精密分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;RE-5299型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;MC-SHZ113型美的電磁爐 廣東美的生活電器制造有限公司;HQ-60型漩渦混勻器 北方同正生物技術發展有限公司;PHS-3C型精密pH計 上海精密科學儀器有限公司;UV-2000型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;HPX-9000型數顯電熱培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;手提式SYQ-DSX-280B型壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 活化培養基、無機鹽溶液、基礎培養基和試驗培養基配制參照Lu等[26]的方法進行。

活化培養基:大豆蛋白胨0.5 g,葡萄糖1.0 g,胰蛋白陳0.5 g,酵母粉1.0 g,吐溫-80 0.1 mL,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05 g,無機鹽溶液4.0 mL(每1 L包含CaCl20.2 g,K2HPO41.0 g,KH2PO41.0 g,MgSO4·7H2O 0.48 g,NaHCO310.0 g,NaCl 2.0 g)。配制時,混合CaCl2和MgSO4在300 mL去離子水中直到溶解,邊攪拌邊緩慢加入其它鹽類,直到所有鹽全部溶解,用去離子水定容至1000 mL,混勻后保存于4 ℃備用),去離子水100 mL,pH=7.0。

基礎培養基(強化梭菌培養基):肉汁1.0 g,酵母粉0.3 g,可溶性淀粉0.1 g,NaAc 0.3 g,多粘菌素B 0.002 g,葡萄糖0.5 g,蛋白胨0.5 g,NaCl 0.5 g,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05 g,去離子水100 mL;pH=6.8±0.2;

試驗培養基:以竹蓀多糖、菊粉取代基礎培養基中的葡萄糖作為碳源配制而成,其他營養成分同基礎培養基。

1.2.2 竹蓀多糖的提取 干燥過的竹蓀子實體用高速粉碎機使其充分粉碎,將其過60目篩后備用。取適量過篩后的竹蓀粉末放入250 mL的異型三角瓶內,按照料液比45 mL/g,在微波功率150 W,超聲波功率550 W條件下進行提取。提取完畢的料液冷卻至室溫后,在4000×g轉速下離心8 min,分離上清液,沉淀按照相同的條件重復提取2次,合并上清液。真空旋轉蒸發(50 ℃)至合并后體積的1/4,濃縮液加入4倍體積的無水乙醇,4 ℃靜置12 h后,離心(4500×g,8 min)。分離出沉淀物,經無水乙醇洗滌后,凍干,得到未分級的竹蓀多糖樣品。

1.2.3 竹蓀分級醇沉多糖制備 準確的稱取1 g竹蓀多糖樣品,加入1000 mL去離子水,充分攪拌使其完全溶解后平均分成5等分(每份200 mL),將乙醇體積分數分別調節至20%、40%、50%、60%和80%,振蕩混勻,4 ℃條件下靜置24 h,分離醇沉產物,通過冷凍干燥得到分級醇沉竹蓀多糖,平行重復測定3次,取其平均值。

1.2.4 竹蓀多糖抗α-淀粉酶水解測試 10 mg竹蓀多糖溶于10 mL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖(PBS)溶液(pH=7),加入2 U/mLα-淀粉酶,37 ℃下孵育6 h,分別于0、1、2、4、6 h測定還原糖及總糖含量;以抗消化能力較強(含有β(1→2)糖苷鍵)的益生元菊粉[27]作為陽性對照組,考察竹蓀多糖與菊粉的抗水解能力差異。

1.2.5 竹蓀多糖抗人工胃液水解能力測試 人工胃液配制[28]:CaCl2·2H2O 0.1 g、Na2HPO48.25 g、MgCl2·6H2O 0.18 g、NaH2PO414.35 g、KCl 0.2 g、NaCl 8 g溶解于1000 mL去離子水中。1 mol/L鹽酸調節 pH=2;準確稱取10 mg竹蓀多糖,加入10 mL人工胃液,37 ℃下孵育6 h,分別于0、1、2、4、6 h測定還原糖及總糖含量,還原糖含量以 DNS法測定,總糖以苯酚-硫酸法[29]測定。還原糖標準曲線:Y=0.7548-0.0015(R2=0.9941),總糖標準曲線:Y=0.0072X-0.0033(R2=0.9984)。

還原糖釋放量=(特定時間點測定的還原糖含量-初始還原糖含量)

1.2.6 菌體濃度測定 用離心機以3000×g的轉速將培養后的雙歧桿菌培養基離心15 min以去除上清液,沉淀的菌體使用去離子水洗滌2次后轉移至具塞螺紋試管,往管中加入30 mL去離子水,用螺旋振蕩器漩渦振蕩液體制成菌體懸液。在兩個干燥離心管(m0)分別準確移取10 mL菌懸液,以3000×g離心10 min后除上清液,將于45 ℃烘箱中干燥其中一離心管至恒重(m),空白對照用無菌去離子水于600 nm波長下測定吸光度值。根據測得的菌體濃度和菌懸液吸光度值間相關性繪制菌體標準曲線,菌體標準曲線為Y=0.3431X-0.0014(R2=0.9997)。吸光度值與其菌體濃度之間有良好的線性關系(菌體濃度0～0.30 g/L范圍內)。

試驗培養基菌體濃度測定:按照上述步驟操作以青春雙歧桿菌液體培養基為基礎制備菌懸液后于600 nm波長下測定吸光度,通過標準曲線并在標準曲線線性范圍內計算菌懸液的菌體濃度。

1.2.7 不同濃度竹蓀多糖對青春雙歧桿菌增殖的影響 將不加葡萄糖(Glc)的基礎培養基分別調整具有抗酸解與酶解的竹蓀多糖(DIP)濃度為0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL,115 ℃濕熱滅菌20 min,取菌種母液以16%的接菌量接種培養基,以菊粉取代Glc作為陽性對照,37 ℃厭氧培養48 h,測定各培養基雙歧桿菌 pH和菌懸液濃度,每個處理重復3次操作。

1.2.8 竹蓀分級醇沉多糖對青春雙歧桿菌增殖的影響 分別以相同濃度(0.5 mg/mL)的竹蓀分級醇沉多糖、菊粉取代基礎中的(Glc),115 ℃濕熱條件下滅菌20 min,取滅菌后的菌種母液以16%的接菌量接種活化培養基,37 ℃厭氧條件下培養20 h后,測定各培養基的雙歧桿菌pH和菌懸液濃度,每個處理重復3次操作。

1.2.9 竹蓀分級醇沉多糖對青春雙歧桿菌生長曲線的影響 以0.5 mg/mL濃度的竹蓀多糖取代基礎培養基中的Glc作為試驗培養基,按照上述條件滅菌后接種于基礎培養基和試驗培養基。37 ℃厭氧培養60 h,分別于不同時間內取樣測定菌體濃度和pH,每個處理重復3次操作。以橫坐標作為培養時間,縱坐標作為菌體濃度,繪制菌體生長曲線。

1.3 數據處理

試驗數據以DPS 10.0軟件進行統計分析,采用OriginPro 9.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 α-淀粉酶對竹蓀分級醇沉多糖水解度的影響

抗α-淀粉酶水解是益生元篩選的先決條件,由圖1可得,隨著水解時間的延長,竹蓀多糖的水解程度在前2 h迅速增加,隨后逐漸趨于平緩,20%、40%、50%、60%竹蓀多糖分級醇沉組分在2 h后增長速度減緩,80%、未分級醇沉組分和菊粉對照組水解基本達到平衡。在α-淀粉酶溶液中水解竹蓀多糖4 h后,20%、40%、50%、60%、80%、未分級醇沉組分水解度分別為9.10%、8.02%、8.88%、11.67%、12.56%、13.91%,對照組菊粉的水解度為13.15%。結果表明20%、40%、50%、60%分級醇沉得竹蓀多糖在α-淀粉酶中水解度與對照組菊粉相比差異顯著(P<0.05);80%、未分級醇沉所得的竹蓀多糖在α-淀粉酶中水解度與對照組菊粉相比無顯著差異(P>0.05),說明在抵抗α-淀粉酶的水解時,低濃度乙醇分級醇沉效果好,具有不被消化酶消化且被腸道菌群利用的潛力。人體消化酶包括唾液淀粉酶、胰淀粉酶、α-淀粉酶等對碳水化合物的水解主要在于α-糖苷鍵。人體上消化道較難消化吸收β-糖苷鍵連接的碳水化合物,可以到達大腸發揮益生元的功效。菊粉中存在β-1,2糖苷鍵,有著較好的抗α-淀粉酶水解的效果。本實驗結果表明,所有醇沉和非醇沉的竹蓀多糖與菊粉一樣均能夠較好地抵抗α-淀粉酶的水解,因此推斷竹蓀多糖具有抗消化性的益生元功能。竹蓀多糖的部分組分與薄荷多糖類似都由半乳糖、葡萄糖、甘露糖的半乳葡甘聚糖組成[12-13],含有β-半乳糖苷結合位點,進而使含有β-半乳糖苷酶的雙歧桿菌能夠有效利用[15]。

圖1 α-淀粉酶對竹蓀多糖分級醇沉組分水解度的影響Fig.1 Effects of α-amylase on hydrolysis of DPs by graded ethanol precipitation

2.2 人工胃液對竹蓀分級醇沉多糖水解度的影響

益生元需要在保證不被人體上消化道消化吸收的情況下,同時能抵抗消化酶和胃酸的水解,進而被腸道有益菌所代謝,因此益生元又被稱為“結腸食物”[30]。本實驗使用模擬胃液考察不同分級醇沉組分竹蓀多糖的水解度,進而對竹蓀多糖的抗胃酸消化性進行評價,以判斷竹蓀多糖的益生元潛力。

從圖2可知,竹蓀多糖在模擬胃液中水解6 h后,20%、40%、50%、60%、80%、未分級醇沉組分水解度分別為17.30%、14.52%、9.61%、8.06%、6.82%和7.90%,對照組菊粉的水解度為5.72%。20%、40%、50%分級醇沉所得的竹蓀多糖與對照組菊粉差異顯著(P<0.05),60%、80%、未分級組分與對照組相比無顯著差異(P>0.05),此外竹蓀多糖水解度隨著水解時間的延長而增加。在模擬胃液中,竹蓀高濃度分級醇沉多糖有較低的水解度,說明在pH=2的酸性條件下竹蓀多糖分級醇沉組分穩定性好于菊粉,采用低濃度醇沉出的多糖分子量較高[31],表明高濃度醇沉的較低分子量的竹蓀多糖在酸性條件下較難被水解成為單糖和二糖,但未分級的竹蓀多糖也較難水解,與80%醇沉多糖具有相似的抗酸水解效果,說明分子量較大的0～20%醇沉組分的抗酸解效果極佳。竹蓀多糖的單糖組成、異頭物構象、環狀結構和連接方式等會對竹蓀多糖在酸性條件下的穩定性產生影響,因此上述兩者水解能力的差異可能由于結構差別造成[32]。一般食物通過人體的胃部需要4 h,實驗結果表明低濃度乙醇分級醇沉及未分級的竹蓀多糖經過胃部后依然能夠較好保持原結構,隨后被腸道益生菌利用。

圖2 人工胃液對竹蓀多糖醇沉組分水解度的影響Fig.2 Effects of artificial human gastric juice on hydrolysis of DPs by graded ethanol precipitation

2.3 不同濃度竹蓀多糖對青春雙歧桿菌增殖的影響

由圖3可知,隨著未分級的DPs添加量的增加,青春雙歧桿菌的菌體濃度呈現先增大而后不斷減小的趨勢;當DPs添加濃度達到0.25 mg/mL后,菌體濃度開始下降,DPs添加濃度達到2.0 mg/mL后，菌體濃度呈直線下降。菊粉對青春雙歧桿菌的生長的影響表現為低濃度快速增長,0.5 mg/mL以后緩慢增長,濃度在2.5 mg/mL以上時,DPs對青春雙歧桿菌的抑制效果優于菊粉。結果表明當DPs濃度低于0.25 mg/mL時,DPs作為碳源被青春雙歧桿菌利用促進菌體生長;當DPs濃度達到0.25 mg/mL后，青春雙歧桿菌的菌體濃度雖不再上升,但仍呈較高濃度,此時青春雙歧桿菌的增殖情況并未受到抑制;當DPs濃度達到1 mg/mL時,能較好的抑制對青春雙歧桿菌的增殖,這可能是由于細菌在高滲透壓DPs中產生的脫水作用抑制了菌體的繁殖。

圖3 竹蓀多糖濃度對青春雙歧桿菌生長量及產酸量的影響Fig.3 Effects of DPs concentrations on the growth and acidifying activity of Bifidobacterium adolescentis

圖3表明,竹蓀多糖濃度對青春雙歧桿菌產酸量存在影響,當DPs濃度低于0.25 mg/mL時,pH從5.3降至5.1,說明這一階段產生大量的有機酸,濃度1.0 mg/mL之前產酸量趨于平穩略微下降而后隨DPs濃度增加產酸量減少、pH增加,而菊粉濃度對產酸量的影響是先迅速減少而后趨于緩慢減少。結果表明竹蓀多糖乙醇醇沉組分在濃度達到2 mg/mL時，對青春雙歧桿菌的增殖效果與產酸量的影響與菊粉相似。竹蓀多糖與竹筍多糖都有類似的益生元效應,能夠促進青春雙歧桿菌增殖。竹蓀中的可溶性多糖主要由葡萄糖、半乳糖、木糖等組成,在低酸度環境下青春雙歧桿菌的增殖受到抑制[33]。

2.4 竹蓀多糖分級醇沉組分對青春雙歧桿菌增殖的影響

由圖4可知,不同的分級醇沉多糖對菌體增殖效果不同,分級醇沉濃度為20%～60%時,菌體濃度在2.1～2.5 g/L,基本保持平穩,差異性不大;分級醇沉濃度為80%時,菌體濃度為3.4 g/L,之后隨分級醇沉濃度增加菌體濃度也增加。分級醇沉濃度達到80%時,青春雙歧桿菌體外增殖作用明顯,效果優于菊粉;分級醇沉濃度低于80%時,青春雙歧桿菌體外增殖效果不明顯,增殖效果不如菊粉。不同的分級醇沉片段對pH亦產生直接影響,pH數值范圍集中于4.7～5.3之間,醇沉濃度為20%時,培養基pH為5.20;醇沉濃度為40%時,pH為5.10;醇沉濃度為50%,pH為5.25;醇沉濃度為60%,pH為5.11;醇沉濃度為80%,pH為5.11;未分級組pH為4.77;菊粉組pH為4.97。在分級醇沉濃度低于80%,產酸量受到限制,pH保持基本穩定,靈芝多糖也主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖等單糖以β-糖苷鍵組成,并且在體內、外實驗中多糖分子量降低的過程中可促進乙酸、丙酸、異丁酸、戊酸和異戊酸等短鏈脂肪酸產生,并在此過程并沒有游離單糖釋放[34]。

圖4 竹蓀多糖分級醇沉組分對青春雙歧桿菌體外增殖的影響Fig.4 Effects of DPs fractions by graded ethanol precipitation on the growth of Bifidobacterium adolescentis注:不同小寫字母表示不同碳源下培養基的青春雙歧桿菌體濃度或pH差異顯著(P<0.05)。

2.5 竹蓀多糖分級醇沉片段對青春雙歧桿菌生長曲線的影響

由圖5可知,高乙醇濃度分級醇沉組分(相同多糖濃度下)更有利于青春雙歧桿菌的增殖。青春雙歧桿菌經培養6 h后菌體進入對數生長期。培養12 h后,青春雙歧桿菌生長達到第一個穩定期,培養18 h后,青春雙歧桿菌的生長再次步入生長期,快速增殖。24 h后20%、40%、50%三個分級醇沉組分的青春雙歧桿菌生長進入衰退期,48 h后進入第二個穩定期;而60%、80%、未分級、菊粉四個分級醇沉組分24 h后,青春雙歧桿菌生長進入穩定期。不同的竹蓀多糖分級醇沉組分,青春雙歧桿菌生長曲線均為典型的微生物生長曲線,都產生兩個生長期和穩定期,充分表明竹蓀多糖分級醇沉組分對青春雙歧桿菌生長影響的復雜性,分子量較大的竹蓀多糖對青春雙歧桿菌的增殖作用較快,其中80%醇沉與未分級的多糖組分與菊粉益生元效果相似。

圖5 竹蓀多糖分級醇沉組分對青春雙歧桿菌生長曲線的影響Fig.5 Effects of DPs fractions by graded ethanol precipitation on the growth curve of Bifidobacterium adolescentis

圖6顯示,隨著培養時間的延長,青春雙歧桿菌產酸量逐漸增加,pH逐漸降低。不同的竹蓀多糖分級醇沉組分對青春雙歧桿菌產酸量存在差異,20%、40%、50%三個分級醇沉組分與60%、80%、未分級、菊粉四個分級醇沉組分相比較,pH下降更緩慢,產酸量更少。20%、40%、50%三個分級醇沉組分pH由6.8降至5.5左右,60%、80%、未分級、菊粉四個分級醇沉組分pH由6.8降至4.5。由圖7可知,pH隨青春雙歧桿菌菌體濃度的提高而不斷降低,與菌體濃度呈負相關。其原因可能是因為多糖被作為碳源物質被益生菌利用,并促進其產酸,導致pH下降[35]。與本實驗結果相似,竹蓀多糖多級醇沉可能導致多糖被溶解從而導致更多短鏈脂肪酸產出,80%醇沉與未分級多糖組分的pH接近菊粉培養基,表明80%醇沉、未分級的多糖組分、菊粉都能促進雙歧桿菌生成活性脂肪酸。

圖6 竹蓀多糖分級醇沉組分對青春雙歧桿菌產酸量的影響Fig.6 Effects of DPs fractions by graded ethanol precipitation on acidifying activity of Bifidobacterium adolescentis

3 結論

不同竹蓀多糖乙醇醇沉組分對青春雙歧桿菌的增殖效果有所不同;分級醇沉濃度達到80%時,青春雙歧桿菌體外增殖作用顯著,乙醇分級醇沉濃度低于80%,產酸量受到限制,pH保持基本穩定。不同竹蓀多糖醇沉組分的增殖效果和抗水解能力隨乙醇濃度的增加而不斷增強,顯示竹蓀多糖對青春雙歧桿菌有較好的增殖效果。研究不同竹蓀多糖乙醇醇沉組分的益生元潛力,為下一步研究多糖的構效關系提供了一定的理論依據,也為簡單制備相應不同功效的多糖組分提供了支持,為提高竹蓀的產業化價值,具有重要的研究意義。