酶法協同超聲波輔助酸法提取柚子皮中果膠工藝條件優化

劉媛潔1,張 良,*,胡歡平1,嚴美婷

(1.江西醫學高等專科學校,江西上饒 334000;2.江西省食品發酵研究所,江西宜春 336000)

果膠(pectin)是一種由聚半乳糖醛酸組成的高分子多糖物質[1-2],是一種膳食纖維,不被人體所吸收,具有多種生理功效,如改善便秘、降血糖、美容養顏、排除體內毒素等,在工業上還可用于增稠劑、乳化劑等[3-5]。天然的果膠類物質常以果膠、原果膠的形態存在于植物細胞中,是構成植物細胞壁的成分之一[6]。有研究表明,柚子皮中含有豐富的果膠,含量可達干物質的30%左右[7]。我國柚子產量高,資源豐富[8],但目前柚子主要是用來鮮食,果皮大多被丟棄,而柚子皮占整個果實重量的30%～50%[9-10],被當作廢棄物棄之會造成資源的浪費,故將柚子皮作為提取果膠的原材料,可大大的提高柚子附加值。

常用的果膠提取方法有酸提取法、超聲波提取法、微波提取法和酶提取法等[11-13]。酸提取法操作簡單,提取的果膠品質好[14-15]。超聲波提取法可利用其產生的空化作用有效地破壞組織的細胞壁,并且能加快物質的擴散速度,從而利于果膠的快速溶出,以提高果膠得率[16]。酶解提取法是利用具有專一性和高效性的酶來分解破壞植物細胞壁和細胞間質等組織結構,從而提高果膠提取率[17]。酶法協同超聲波輔助酸提取法能有效結合酶解提取法、超聲波提取法和酸提取法三者的優點,能協同有效地提高果膠的提取率,用時短,應用性強[18]。目前以酶法協同超聲波輔助酸法提取柚子皮中的果膠尚未見報道。

本研究以江西廣豐成熟期的馬家柚為原料,采用酶法協同超聲波輔助酸法提取柚子皮中的果膠,在單因素實驗基礎上,運用Plackett-Burnman試驗設計篩選出對果膠得率有顯著影響的要素因子,進一步采用Box-Behnken試驗設計優化了柚子皮中果膠的提取工藝,可為柚子皮的深加工提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柚子 產自江西廣豐成熟期的馬家柚;纖維素酶(2×104U/g) 北京索萊寶科技有限公司;無水乙醇、濃鹽酸(均為分析純) 西隴化工股份有限公司。

HH-4恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;KQ-400KDE超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;ML204電子天平 上海精科天美有限公司;GZX-9240MBE電熱鼓風干燥箱 無錫萊蒲儀器設備有限公司;PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 柚子皮的預處理 將新鮮柚皮切成碎塊,用熱水漂洗數次至無色,再置于60 ℃下干燥24 h,粉碎后過60目篩,將制備好的柚子粉末放入干燥器中密封備用。

1.2.2 柚子皮中果膠提取流程 稱取適量柚子皮粉末于500 mL錐形瓶中,以一定的料液比加入蒸餾水,根據柚子皮的質量加入一定量的纖維素酶進行水浴酶解一定時間,酶解完后用鹽酸調節提取液至一定pH,然后置于超聲波清洗機中在一定的功率計一定的提取溫度下超聲一定的時間提取果膠,提取完成后4000 r/min離心20 min,取上清液。再將1.5倍體積的無水乙醇緩慢加入上清液中,并不斷攪拌,靜置一段時間后8500 r/min離心10 min,收集沉淀,置于55 ℃烘箱中干燥至恒重得到果膠。

1.2.3 柚子皮中果膠提取工藝優化

1.2.3.1 酶用量的確定 按照 1.2.2的方法,固定料液比為1∶20 g/mL,酶解時間為70 min,提取液pH為2.0,超聲功率為250 W,提取溫度為80 ℃,提取時間為30 min,研究酶用量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對柚子皮中果膠得率的影響。

1.2.3.2 酶解時間的確定 選擇最佳酶用量,固定料液比為1∶20 g/mL,提取液pH為2.0,超聲功率為250 W,提取溫度為80 ℃,提取時間為30 min,研究酶解時間(30、50、70、90、110 min)對柚子皮中果膠得率的影響。

1.2.3.3 料液比的確定 選擇最佳酶用量、酶解時間,固定提取液pH為2.0,超聲功率為250 W,提取溫度為80 ℃,提取時間為30 min,研究料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL)對柚子皮中果膠得率的影響。

1.2.3.4 提取液pH的確定 選擇最佳酶用量、酶解時間及料液比,固定超聲功率為250 W,提取溫度為80 ℃,提取時間為30 min,研究提取液pH(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0)對柚子皮中果膠得率的影響。

1.2.3.5 超聲功率的確定 選擇最佳酶用量、酶解時間、料液比和提取液pH,固定提取溫度為80 ℃,提取時間為30 min,研究超聲功率(150、200、250、300、350 W)對柚子皮中果膠得率的影響。

1.2.3.6 提取溫度的確定 選擇最佳酶用量、酶解時間、料液比、提取液pH和超聲功率,固定提取時間為30 min,研究提取溫度(70、75、80、85、90 ℃)對柚子皮中果膠得率的影響。

1.2.3.7 提取時間的確定 在上述最佳酶用量、酶解時間、料液比、提取液pH、超聲功率和提取溫度基礎上,研究提取時間(10、20、30、40、50、60 min)對柚子皮中果膠得率的影響。

1.2.3.8 Plackett-Burman試驗 以果膠得率為響應值,單因素實驗為基礎,選取酶用量、酶解時間、料液比、提取液pH、超聲功率、提取溫度和提取時間共7個因素的水平值,選用Plackett-Burman試驗設計確定顯著性影響因素,為進一步Box-Behnken試驗奠定基礎。試驗設計因素及水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素及水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman

1.2.3.9 響應面試驗 在Plackett-Burman試驗基礎上,以酶用量、超聲功率、提取溫度和提取時間為自變量,以柚子皮中果膠得率為響應值,設計響應面試驗,確定最佳果膠提取工藝。Box-Behnken試驗設計見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計Table 2 Design of Box-Behnken test

1.2.4 果膠得率的測定 果膠的得率采用重量法[19]。按照下列公式計算:

1.3 數據處理

所有試驗均重復3次,結果取平均值,運用Excel軟件繪制趨勢曲線圖。采用JMP Trial 14軟件進行Plackett-Burman試驗設計及數據處理,用Design-Expert 7.0軟件進行Box-Behnken試驗設計及數據分析。

2 結果與分析

2.1 果膠提取單因素實驗結果

2.1.1 酶用量的確定 由圖1可知,當纖維素酶用量低于2.0%時,柚子皮中果膠得率隨著酶用量的增加而增加,這可能是由于纖維素酶分解破壞了柚子皮細胞的細胞壁結構,使得柚子皮中的果膠更易溶出,從而提高了果膠得率[16,20]。當酶用量為2.0%時,果膠得率達最大,為21.67%。繼續增大酶用量,果膠得率基本無變化,可能是由于反應底物已全部被結合[21],導致果膠得率不再增加。因此選擇酶用量為2.0%。

圖1 酶用量對果膠得率的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on the yield of pectin

2.1.2 酶解時間的確定 由圖2可知,隨著酶解時間延長,柚子皮中果膠得率呈現先增加后緩慢減少的趨勢,當酶解時間為70 min時,果膠得率達最大值,可能是酶解時間達到70 min后,酶解基本完全,繼續延長酶解時間,會造成部分果膠水解,使得果膠得率降低。因此選擇酶解時間為70 min。

圖2 酶解時間對果膠得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of pectin

2.1.3 料液比的確定 由圖3可知,柚子皮中果膠得率隨著料液比的增大而增加,當料液比為1∶25 g/mL時,果膠得率達最大值。繼續增大料液比,果膠得率反而下降,可能是提取液比例過大,溶液中的果膠濃度太低,不利于果膠的溶出。因此選擇料液比為1∶25 g/mL。

圖3 料液比對果膠得率的影響Fig.3 Effect of material liquid ratio on the yield of pectin

2.1.4 提取液pH的確定 由圖4可知,提取液pH在1.0～3.0范圍內,柚子皮中果膠得率隨著pH的增大,呈現先增加后減少的趨勢。當pH為2.0時,果膠得率達最大值。可能是由于pH低于2.0時,酸性太強,導致果膠水解過度;pH高于2.0時,因為提取液酸性減弱,使得原果膠水解成果膠的程度隨著提取液pH的升高而降低[22],從而導致果膠得率降低。因此選擇提取液pH為2.0。

圖4 pH對果膠得率的影響Fig.4 Effects of pH on the yield of pectin

2.1.5 超聲功率的確定 由圖5可知,當超聲功率在150～300 W范圍內,柚子皮中果膠得率隨著超聲功率的增大而增加,超聲功率為300 W時,果膠得率達最大值,繼續增大超聲功率,果膠得率顯著下降,可能是因為功率過高,超聲波的空化作用過強,導致果膠水解過度,裂解成了多糖分子[23],從而使果膠得率下降。因此選擇超聲功率為300 W。

圖5 超聲功率對果膠得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the yield of pectin

2.1.6 提取溫度的確定 由圖6可知,柚子皮中果膠的得率隨超聲提取溫度的升高呈現先增加后減少的趨勢,當酶解溫度為80 ℃時,果膠得率達最大值,提取溫度超過80 ℃后,會使果膠發生水解,導致得率降低。因此選擇提取溫度為80 ℃。

圖6 提取溫度對果膠得率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on the yield of pectin

2.1.7 提取時間的確定 由圖7可知,提取時間對柚子皮中果膠得率的影響較大,隨著提取時間的延長,果膠得率呈現先增加后減少的趨勢,當提取時間為40 min時,果膠得率達最大值,為25.71%。提取時間低于40 min時,柚子皮中的原果膠未完全水解,使得果膠得率較低,但提取時間過長時,溶液中的果膠在高溫酸性條件下會被降解[15],導致果膠得率下降。因此選擇提取時間為40 min。

表5 偏回歸系數及顯著性檢驗Table 5 Partial regression coefficients and their significance test

圖7 提取時間對果膠得率的影響Fig.7 Effect of extraction time on the yield of pectin

2.2 果膠提取Plackett-Burman試驗結果

Plackett-Burman試驗設計及響應值見表3,方差分析結果見表4,偏回歸系數及顯著性檢驗見表5。

表3 Plackett-Burman設計的各因素水平及響應值Table 3 Experimental design and response results of Plackett-Burman design

表4 Plackett-Burman 設計方差分析表Table 4 Analysis of variance of Plackett-Burman design

用JMP軟件對表3中的實驗數據進行回歸分析和顯著性檢驗。由表4可知,該模型顯著(P<0.05)。由表5可知,因素X1(酶用量)、X5(超聲功率)、X6(提取溫度)和X7(提取時間)對柚子皮中果膠得率影響顯著(P<0.05),所以選擇X1、X5、X6、X7共4個因素進行響應面優化試驗;因素X2(酶解時間)、X3(料液比)和X4(提取液pH)對柚子皮中果膠得率影響不顯著,故在后續優化試驗中因素X2、X3和X4的條件固定為:酶解時間70 min、料液比1∶25 g/mL、提取液pH2.0。

2.3 果膠提取響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計與結果分析 響應面試驗結果見表6,用Design-Expert 7.0軟件處理試驗數據,經非線性回歸的二次多項式擬合,得到回歸模型為:Y=26.28+0.22A+0.23B-0.0075C+0.037D-0.27A2-0.27B2-0.12C2-0.14D2+0.050AB+0.067AC-0.040AD-0.0075BC+0.037BD+0.023CD,對回歸模型進行方差分析,結果見表7。

表6 響應面試驗設計及結果Table 6 Experimental design and results for response surface

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

圖8 酶用量和提取溫度交互作用的響應面圖Fig.8 Response surface of interaction of enzyme dosage and extraction temperature

由圖8可知,酶用量和提取溫度兩因素的交互作用對果膠得率的影響較大,得率隨著酶用量的增加和提取溫度的升高,均出現先增大后減小的趨勢,響應面為凸型曲面,表明果膠得率存在極大值。

2.3.2 最優工藝條件及驗證試驗 根據模型預測得到的最佳柚子皮中果膠提取工藝條件為:酶用量1.71%、超聲功率262.79 W、提取溫度83.07 ℃,提取時間49.86 min,在此最佳條件下,果膠得率理論上可達27.89%。考慮實驗的可操作性,修正最佳的工藝條件為:酶用量1.7%、超聲功率260 W、提取溫度83 ℃,提取時間50 min,在此條件下得出實際測得的果膠得率為27.01%±0.91%,與預測值的相對誤差為0.88%,說明該模型擬合程度良好。

3 結論

通過優化酶法協同超聲波輔助酸法提取柚子皮中果膠的工藝,得到最佳工藝條件為:酶用量1.7%、酶解時間70 min、料液比1∶25 g/mL、提取液pH2.0、超聲功率260 W、提取溫度83 ℃,提取時間50 min,在此條件下從柚子皮中提取果膠的得率為27.01%±0.91%。該方法結合了酶解提取法、超聲波提取法和酸提取法三者的優點,有效地提高了果膠得率,從而提高了柚子皮的附加值。