響應面法優化超聲協同復合酶分步提取恰瑪古多糖工藝

(江西中醫藥大學藥學院,江西南昌 330004)

恰瑪古為十字花科蕓薹屬二年生草本植物,學名蕪菁(BrassicarapaL.),又稱“蔓菁”、“諸葛菜”;根肥大肉質成球狀,是食用和入藥主要部位,恰瑪古藥食兩用歷史悠久,是維吾爾族傳統的藥食兩用植物,被稱為“長壽圣果”[1];其藥用始載于《名醫別錄》,“味苦溫、無毒;主利五臟,輕身益氣,可長食之”[2],《本草綱目》記載其“辛、苦、平,無毒,可升可降,能汗能吐,能下能利小便,又能明目解毒,其效甚偉”[3]。維吾爾族醫藥理論認為恰瑪古具有“生濕生熱、營養全身、肥體強身、潤肺止咳、增強食欲、軟便利尿、填精壯陽、明目增視之功效”[4]。近年來研究人員發現恰瑪古多糖主要由半乳糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖等組成,具有降血糖、抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、抗炎和免疫調節等作用[5],因此,恰瑪古多糖可應用于醫藥衛生和飲食保健等領域,作為綠色天然生物醫藥產品,有著廣闊的市場前景。

目前關于恰瑪古多糖的提取主要以水提醇沉法為主,但有費時、得率低等缺點[6-7]。近些年興起的超聲輔助提取法已廣泛應用于中藥有效成分的提取,超聲產生的空化作用能夠促進分子的運動,促使有效成分的溶出,提高有效成分的提取效率[8]。蔡嘯鏑等[9]以恰瑪古為原料,利用響應面法對超聲輔助提取恰瑪古多糖的工藝條件進行優化,在液料比16.7∶1 mL/g、乙醇體積分數75.1%、超聲功率為156.4 W條件下超聲提取65.4 min,多糖的提取率為6.86%。

目前,復合酶提取法已廣泛應用于植物多糖的提取,且復合酶提取法具有反應條件溫和、高效、能耗低的特點。蔣德旗等[10]以金櫻子根為原料,在單因素實驗基礎上采用響應面法優化復合酶提取金櫻子根多糖工藝,表明在酶添加量2.1%、酶解pH4.4、料液比16∶1 g/mL、溫度45 ℃條件下酶解49 min,多糖提取率為14.15%。關于超聲協同復合酶分步提取恰瑪古多糖的研究鮮有報道。本文以恰瑪古多糖得率為響應值,在單因素考察基礎上利用Box-Behnken進行試驗設計,優化超聲協同復合酶分步提取恰瑪古多糖的工藝,以期為恰瑪古多糖的開發與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

恰瑪古干品 新疆阿克蘇地區(批號:20180711),鑒定人為江西中醫藥大學中藥資源與民族藥研究中心杜小浪教授;磷酸氫二鈉、檸檬酸、葡萄糖、濃硫酸、苯酚 均為分析純,西隴化工股份有限公司;果膠酶(40 U/mg)、纖維素酶(3 U/mg)、木瓜蛋白酶(80萬U/g) 北京索萊寶科技有限公司。

YF-118B型高速中藥粉碎機 瑞安市永歷制藥機械有限公司;UV-8000S雙光束紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;HH-6型數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器儀器有限公司;SQP電子天平 塞多利斯科學儀器(北京)有限公司;KQ-300TDB數控超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 恰瑪古多糖含量的測定

1.2.1.1 葡萄糖標準曲線的繪制 采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。準確稱取100 mg無水葡萄糖標準品置于100 mL量瓶中,加蒸餾水定容至刻度,再取出1.0 mL溶液稀釋定容10 mL得0.10 mg/mL的葡萄糖標準溶液。分別取0.10 mg/mL的葡萄糖標準溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL于7支25 mL比色管中,各補蒸餾水至2.0 mL,分別加入1.0 mL濃度為5%的苯酚溶液,混勻后迅速加入5.0 mL濃硫酸,靜置10 min后置于沸水浴中反應15 min,取出冷卻至室溫,在490 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標,葡萄糖質量濃度為橫坐標,繪制葡萄糖標準曲線。得線性回歸方程:Y=13.156X+0.0973,R2=0.9988。

1.2.1.2 恰瑪古多糖的提取及測定 將干燥的恰瑪古藥材粉碎,60目過篩,石油醚回流2 h脫脂,自由揮干,50 ℃真空烘干,得預處理樣品。稱取1.0 g預處理樣品,加入一定體積的蒸餾水,在一定的溫度下超聲提取一定時間。在最佳超聲波條件提取結束后,加入緩沖液和復合酶(纖維素酶∶木瓜蛋白酶∶果膠酶=1∶1∶1，質量比),水浴恒溫酶解反應一定時間后,置于沸水浴滅酶10 min,冷卻至室溫,離心取上清液,減壓濃縮后加入4倍體積95%乙醇,4 ℃靜置12 h,離心,收集沉淀并依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌,溶解定容至25 mL,得恰瑪古多糖提取液,備用。

精密吸取0.10 mL制備的多糖提取液,置于15 mL具塞試管中,補蒸餾水至2.0 mL,其余步驟同1.2.1.1,在490 nm波長處測定吸光度,根據葡萄糖標準曲線計算多糖的質量濃度。

式中:C為多糖質量濃度(mg/mL);V為提取液定容體積(mL);D為樣品稀釋倍數;M為恰瑪古質量(g)。

1.2.2 超聲提取單因素實驗 準確稱取1.0 g恰瑪古粉末若干份,固定實驗條件液料比為20∶1 mL/g、超聲功率為200 W,超聲溫度為60 ℃,超聲時間40 min,分別考察液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)、超聲溫度(40、50、60、70、80 ℃)、超聲時間(20、30、40、50、60 min)、超聲功率(100、150、200、250、300 W)對多糖得率的影響。

1.2.3 復合酶酶解單因素實驗 準確稱取1.0 g恰瑪古粉末若干份,在最佳超聲波條件提取結束后,加入復合酶進行酶解反應,用磷酸氫二鈉和檸檬酸緩沖溶液調節pH。固定實驗條件酶解pH5.0、酶加入量為1.5%、酶解時間為40 min、酶解溫度為60 ℃,分別考察pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)、酶解溫度(40、50、60、70、80 ℃)、酶加入量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、酶解時間(20、30、40、50、60 min)對多糖提取率的影響。

1.2.4 超聲提取響應面試驗設計 根據超聲提取單因素實驗結果,選取液料比、超聲溫度、超聲時間及超聲功率為實驗因素,采用Box-Behnken設計方法,建立四因素三水平RSM分析試驗,RSM分析因素與水平見表1。

表1 超聲波條件響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of ultrasonic conditional response surface analysis

1.2.5 復合酶酶解響應面試驗設計 在最佳超聲波條件提取結束后,加入復合酶進行酶解反應。根據單因素試驗結果,選取pH、酶解溫度、酶解時間及酶加入量為實驗因素,采用Box-Behnken設計方法,建立四因素三水平RSM分析試驗,RSM分析因素與水平見表2。

表2 復合酶酶解條件響應面分析因素與水平Table 2 Factors and levels of conditional response surface analysis for complex enzyme hydrolysis

1.3 數據處理

每組實驗重復3次,采用Excel 2010和SPSS 20.0軟件分析數據及作圖,Box-Behnken設計采用Design Expert 8.0.6軟件并進行響應面分析,實驗結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 超聲提取單因素實驗結果

2.1.1 液料比對多糖得率的影響 由圖1所示,隨著液料比的增大,其整體趨勢先增大后減小。液料比小于30∶1 mL/g時,細胞內、外多糖濃度梯度增大,利于多糖向水中擴散,多糖得率增大[11];當液料比大于30∶1 mL/g時,單位體積水吸收的超聲能量降低,得率隨之降低[12]。因此,選擇液料比為30∶1 mL/g進行后續優化試驗。

圖1 液料比對多糖得率的影Fig.1 Effect of liquid to material ratio on the yield of polysaccharides

2.1.2 超聲溫度對多糖得率的影響 由圖2所示,隨著溫度升高,其整體趨勢先增大后減小。具體為超聲溫度小于60 ℃時,隨著溫度升高,有利于多糖溶出,多糖得率增大;當溫度大于60 ℃時,多糖得率降低,可能但溫度過高導致多糖結構可能被破壞[13]。因此,選擇超聲溫度為60 ℃進行后續優化試驗。

圖2 超聲溫度對多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the yield of polysaccharides

2.1.3 超聲時間對多糖得率的影響 由圖3所示,隨著超聲時間延長,其整體趨勢先增加后減小,具體為超聲時間小于40 min 時,隨著超聲時間增加,多糖得率逐漸提高;當超聲時間大于40 min時,多糖得率降低,可能長時間超聲使多糖降解[14];當超聲時間為40 min時,多糖得率最高。因此,選擇超聲時間為40 min進行后續優化試驗。

圖3 超聲時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of polysaccharides

2.1.4 超聲功率對多糖得率的影響 由圖4所示,隨著超聲功率增大,其整體趨勢先增加后減小,超聲功率小于250 W時,隨著超聲功率增大,多糖得率逐漸提高;當超聲功率大于250 W時,多糖得率降低,可能過高的超聲功率導致多糖降解[14];當超聲功率為250 W時,多糖得率達到最大。因此,選擇超聲功率為250 W進行后續優化試驗。

圖4 超聲功率對多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharides

2.2 復合酶酶解單因素實驗結果

2.2.1 酶解pH對多糖得率的影響 由圖5所示,隨著酶解pH增大,其整體趨勢先增加后減小,具體為pH<5.0時,隨著pH的增大,復合酶活性升高,酶解能力加強,多糖提取率增大;當pH>5.0時,復合酶活性降低,多糖得率減小[10,15];當pH為5.0時,多糖得率達到最大。因此,選擇酶解pH為5.0進行后續優化試驗。

圖5 酶解pH對多糖得率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis of pH on the yield of polysaccharides

2.2.2 酶解溫度對多糖得率的影響 由圖6所示,隨著溫度升高,其整體趨勢先增加后減小;溫度小于50 ℃時,隨著溫度的上升,復合酶活性增強,酶解能力提高,多糖得率增大;當溫度大于50 ℃時,隨著溫度的上升復合酶活性降低,多糖得率下降[16];當溫度為50 ℃時,多糖得率達到最大。因此,選擇酶解溫度為50 ℃進行后續優化試驗。

圖6 酶解溫度對多糖得率的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of polysaccharides

2.2.3 酶加入量對多糖得率的影響 由圖7所示,隨著酶加入量增多,其整體趨勢先增加后減小;酶加入量小于2.5%時,隨著加入復合酶量增加,多糖得率逐漸增大;當酶加入量大于2.5%時,復合酶濃度增大,酶解效率降低,多糖得率下降[17];當酶加入量為2.5%時,多糖得率達到最大。因此,選擇酶加入量為2.5%進行后續優化試驗。

圖7 酶加入量對多糖得率的影響Fig.7 Effect of enzyme addition on the yield of polysaccharides

2.2.4 酶解時間對多糖得率的影響 由圖8所示,隨著酶解時間延長,其整體趨勢先增加后穩定;酶解時間小于50 min時,酶解反應未完全,多糖得率隨時間的延長逐漸提高;當酶解時間大于50 min時,多糖得率增加不明顯[10,15];當酶解時間為50 min時,多糖得率達到最大。因此,選擇酶解時間為50 min進行后續優化試驗。

圖8 酶解時間對多糖得率的影響Fig.8 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of polysaccharides

2.3 RSM優化超聲提取工藝條件

2.3.1 回歸模型建立及方差分析 Box-Behnken實驗設計及結果見表3,利用Design Expert 8.0.6軟件對數據進行模型擬合,結果為Y=7.01+0.14A+0.39B+0.4C+0.35D+0.27AB+0.036AC-0.1AD+0.24BC+0.013BD+0.07CD-0.35A2-1.1B2-0.2C2-0.32D2。

方差試驗分析結果見表4。由表4可知,模型的P<0.0001,此回歸模型極顯著,失擬項(P=0.0557>0.05)不顯著,決定系數R2=0.9487,表明該模型與試驗擬合較好,可適用于分析和預測恰瑪古多糖提取工藝。各因素對恰瑪古多糖得率的影響大小為:超聲溫度>超聲時間>超聲功率>液料比。

表3 超聲波條件Box-Behnken試驗設計與結果Table 3 Box-Behnken design and experiment results for ultrasonic conditional

表4 超聲波條件回歸模型方差分析結果Table 4 Results of variance analysis of regression model for ultrasonic conditional

2.3.2 響應面交互作用分析及優化結果 根據回歸模型,將任兩因素固定在零水平,可以得到另外兩因素交互作用的響應曲面及相應等高線圖,反映各因素交互作用對超聲提取多糖得率的影響[18]。超聲提取階段各因素交互作用見圖9。響應曲面陡峭程度和等高線圖的形狀可反映各因素間的交互作用的顯著與否,當兩因素間交互作用顯著時,響應面越陡,等高線呈橢圓形;反之,響應面越緩,等高線呈圓形[19-20]。由圖9可知,在交互項對超聲提取恰瑪古多糖得率的影響中,液料比與超聲溫度之間交互作用顯著(P<0.05),其他因素之間交互作用不顯著,與方差分析結果一致。

圖9 各因素交互作用對超聲提取多糖得率影響的響應面圖Fig.9 Response surface diagram of the effect of interaction of various factors on the yield of polysaccharides extracted by ultrasound

表5 復合酶酶解Box-Behnken試驗設計與結果Table 5 Box-Behnken design and experiment results for complex enzyme hydrolysis

利用Design-Expert 8.0.6軟件優化得到多糖超聲提取最佳工藝:液料比32.85∶1 mL/g、提取溫度61.63 ℃、超聲功率250 W、超聲時間 43.09 min,多糖理論預測得率為7.46%。結合實際操作后最終確定優選方案為:液料比33∶1 mL/g、提取溫度62 ℃、超聲功率250 W、超聲時間43 min;在此條件下3次驗證試驗測得多糖得率為7.32%±0.16%,與理論預測值7.46%無顯著差異。

2.4 RSM優化復合酶酶解工藝條件

2.4.1 回歸模型及方差分析 Box-Behnken實驗設計及結果見表5,利用Design Expert 8.0.6軟件對數據進行模型擬合,結果為Y=12.65+0.50A-6.667×10-3B-0.062C+0.48D+0.11AB+0.13AC-0.21AD-0.38BC-0.11BD-0.57CD-0.61A2-0.77B2-1.43C2-1.08D2。

方差試驗分析結果見表6,由表6可知,模型的P<0.0001,此回歸模型極顯著,失擬項(P=0.4316>0.05)不顯著,決定系數R2=0.9715,表明該模型與試驗擬合較好,可適用于分析和預測恰瑪古多糖提取工藝。

2.4.2 響應面交互作用分析及優化結果 利用Design-Expert 8.0.6軟件的Model Graphs模塊,固定酶解pH(A)、酶解溫度(B)、酶加入量(C)、酶解時間(D)其中的兩個因素為零水平,可得到另外兩因素的交互作用對多糖得率的影響,可通過響應曲面更加直觀地表現出來,結果見圖10。由圖10所示,BC和CD兩兩因素響應曲面較陡,表明酶解溫度與酶加入量和酶加入量與酶解時間之間交互作用對響應值的影響極顯著(P<0.01),與方差分析結果一致。

表6 復合酶酶解回歸模型方差分析結果Table 6 Results of variance analysis of regression model for complex enzyme hydrolysis

2.5 最佳工藝條件確定和驗證實驗

通過回歸模型預測,得到超聲協同復合酶分步提取恰瑪古多糖的最佳工藝條件,超聲提取階段最佳條件為:液料比32.85∶1、超聲溫度61.63 ℃、超聲功率250 W、超聲時間 43.09 min,復合酶解階段最佳條件為:酶解pH5.38、酶解溫度50.02 ℃、酶加入量2.48%、酶解時間51.97 min,多糖理論得率為12.79%。為便于實際操作,將此工藝條件調整為:在液料比33∶1 mL/g、溫度62 ℃、超聲功率250 W條件下超聲提取43 min后;加入復合酶進行酶解反應,酶解條件為酶解pH5.4、酶解溫度50 ℃、酶加入量2.5%、酶解時間52 min,在此工藝條件下進行3次平行驗證試驗,恰瑪古多糖得率為12.62%±0.18%,與理論預測值12.79%相近,說明該回歸模型實驗設計可靠,采用響應面法優化恰瑪古多糖提取工藝是可行的。

3 結論

本實驗通過對超聲輔助和復合酶兩步法提取恰瑪古中多糖的工藝研究,最終得到超聲輔助和復合酶兩步法提取多糖的最佳工藝條件為:超聲輔助提取階段為液料比33∶1 mL/g、超聲溫度62 ℃、超聲功率250 W、超聲時間43 min;復合酶法提取階段為酶解pH5.4、酶解溫度50 ℃、酶加入量2.5%、酶解時間52 min,在此條件下恰瑪古多糖提取率為12.62%±0.18%,與預測值12.79%無顯著差異。

因此,超聲協同復合酶分步提取法適用于恰瑪古多糖的提取,與傳統超聲輔助提取法(6.86%)高5.76%[9],比傳統熱水浸提法(8.86%)高3.76%[6];并具有提取率高、條件溫和、高效等優點,可在恰瑪古多糖提取工藝及生產中推廣應用。