競爭化學發光酶免疫檢測動物源性食品中四環素殘留

(南京海關動植物與食品檢測中心,江蘇南京 210000)

目前,TCs的檢測方法有紫外分光光度法(ultraviolet and visible spectrophotometry,UV-Vis)、微生物法(microorganism method)[7]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[8-9]、質譜法(massspectrometry,MS)[10]、液相色譜-質譜聯用法(liquid chrometography-massspectrometry,LC-MS)[11-13]、薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)、毛細管電泳法(capillary electrophoresis,CE)、化學發光法(chemiluminescence,CL)、酶聯免疫檢測法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[14-15]。色譜方法操作步驟繁瑣,且需精密儀器,而免疫分析法具有操作簡便快速、特異性高等特點,有良好的應用前景。競爭化學發光酶免疫測定法(cempetitive chemiluminescent enzyme immunity,CLEIA)是將化學發光和酶聯免疫反應相結合的一種技術,具有靈敏度高、線性范圍寬、分析方法更簡便快速、穩定性強等特點。

本研究建立一種用于四環素的競爭化學發光酶免疫定量測定法,并對反應參數進行優化以提高檢測的特異性及靈敏度,以期為四環素的定量測定提供一種簡便的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

20只雄性小鼠 體重20～25 g,北京維通利華實驗動物技術有限公司,飼養于江蘇省農業科學院實驗動物中心;四環素、金霉素、土霉素、強力霉素、氯霉素、青霉素 純度為99%，美國Sigma公司;四環素單抗 蘇州快捷康公司;血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)以及卵清白蛋白(ovalbumin,OVA) 美國Sigma公司;包被液 0.05 mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液,pH9.6;封閉液 1%BSA溶液;洗液 0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液(PBST);稀釋液 磷酸鹽緩沖液(PBS);HRP-四環素單抗用辣根過氧化酶(HRP)標記的四環素單抗 可4 ℃短期保存,-20 ℃長期保存;CLEIA化學發光液 AB液1∶1混合液,現用現配,A液魯米諾含量為0.01 mol/L、對甲苯酚含量為0.001 mol/L pH8.8的三羥甲基氨基甲烷溶液,B液每100 mL溶液含檸檬酸2.1 g、無水Na2HPO42.82 g、0.75%的過氧化氫脲0.64 mL的水溶液。

DK-8D恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司;96孔化學發光可拆卸白板 美國Corning公司;PHX-2012化學發光儀 北京普朗新科技有限公司;MULTISKAN FC酶標儀、Ultra液質聯用儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;FD-1-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;LP115 pH計 德國MettlerToledo GmbH公司;TISS-24組織研磨儀 上海凈信科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 稱取0.1 mg四環素標準品,用1 mL PBS溶解成0.1 mg/mL的母液。吸取10 μL母液到9.99 mL PBS溶液中制備成100 μg/L的標準品1;吸取5 mL標準品1加到5 mL PBS溶液中制備成50 μg/L的標準品2;吸取1 mL標準品2加到4 mL PBS溶液中制備成10 μg/L的標準品3;吸取1 mL標準品3加到9 mL PBS溶液中制備成1 μg/L的標準品4;吸取1 mL標準品4加到9 mL PBS溶液中制備成0.1 μg/L的標準品5;吸取1 mL標準品5加到9 mL PBS溶液中制備成0.01 μg/L的標準品6,制備成一系列濃度(0.01、0.1、1、10、50、100 μg/L)的四環素標準溶液。

1.2.2 抗原包被載體蛋白的選擇 將四環素與BSA/OVA/KLH進行偶聯:稱取10 mg載體蛋白,加入10 mL(0.1 mol/L)的MES緩沖液中,配制成1 mg/mL的A溶液;量取100 μL(10 mg/mL)四環素溶于DMSO中,補加400 μL DMF,配制成B溶液;將B溶液逐滴加入到A溶液中,邊加邊用力攪拌;補加7.35 mL DMF,然后迅速加入37%甲醛3.57 mL,于37 ℃水浴振蕩反應24 h;4 ℃條件下用去離子水充分透析16～24 h,平均每4 h換一次蒸餾水,將其分裝真空冷凍干燥機凍干后備用。應用Bradford法對偶聯前后各載體蛋白濃度進行測定,計算各載體蛋白的偶聯效率[16]。

根據相關要求，進一步明確洪澤湖水源調度：①洪澤湖水位在12.5 m以上時，水源由省防汛防旱指揮部統一調度。②當洪澤湖水位在12.5 m以下時，按省規定，除經薔北地涵及沭新退水閘（含桑墟水電站）向連云港市送水50 m3/s、向廢黃河送水15～20 m3/s外，其余部分由省防汛防旱指揮部統一調度給淮安、宿遷等市縣使用。③當洪澤湖水位降至11.3 m時，由于二河閘出量不足， 向連云港市及廢黃河送水的流量將相應減少，但為了確保連云港港口和城市用水，根據大旱年份1992年的實際情況，在任何形式下，通過薔北地涵及沭新退水閘向連云港送水不得少于30～40 m3/s。

偶聯效率(%)=(偶聯前載體蛋白濃度-偶聯后載體蛋白濃度)/四環素質量×反應體積

1.2.3 CLEIA測定法反應條件的優化 用包被液稀釋偶聯抗原底物至1 μg/mL,100 μL/孔包被于96孔化學發光板,4 ℃孵育過夜。棄掉液體,PBST洗5次,30 s/次,拍干。加封閉液,200 μL/孔,37 ℃ 孵育2 h,棄掉液體,PBST洗5次,30 s/次,拍干。每孔加入100 μL四環素抗原(1 μg/L)和100 μL HRP-四環素抗體(1 μg/mL),分別在室溫(20 ℃)和37 ℃下振蕩反應20、30、60 min,以及不振蕩反應20、30、60 min,棄掉液體,PBST洗5次,30 s/次,拍干。加入化學發光液100 μL/孔,立刻置于化學發光儀上讀相對發光值(relative light unit,RLU)。選擇RLUmax最大、IC50值最小、RLUmax/IC50最大的反應條件作為該測定法的反應體系,此時的檢測范圍最廣、靈敏度最低。

1.2.4 競爭化學發光酶免疫測定法(CLEIA)標準曲線的確立 用包被液稀釋偶聯抗原底物至1 μg/mL,100 μL/孔包被于96孔化學發光板,4 ℃ 孵育過夜。棄掉液體,PBST洗5次,30 s/次,拍干。加封閉液,200 μL/孔,37 ℃ 孵育2 h,棄掉液體,PBST洗5次,30 s/次,拍干。每孔加入100 μL四環素抗原(濃度分別為0.01、0.1、1、10、50、100 μg/L)和100 μL HRP-四環素抗體(1 μg/mL),37 ℃ 振蕩孵育30 min,棄掉液體,PBST洗5次,30 s/次,拍干。加入化學發光液100 μL/孔,立刻置于化學發光儀上讀相對發光值(relative light unit,RLU)。以四環素標準品濃度為X軸,以抑制率為Y軸繪制標準曲線。

1.2.5 競爭化學發光酶免疫測定法性能評估 用PBS稀釋制備一系列濃度(0.01、0.1、1、10、50、100 μg/L)的四環素標準品,按照1.2.3部分所示步驟,在最優實驗條件下,繪制標準曲線。

檢測限是指IC10所對應的濃度值。檢測范圍是指IC15～IC90所對應的濃度值范圍。靈敏度是指抑制率為50%時(IC50)的濃度。

1.2.6 添加回收試驗

1.2.6.1 樣品前處理 隨機選擇市場上的空白豬肉(去除脂肪)、魚肉(去除骨頭)、雞肝作為實驗樣本,添加不同濃度的四環素標準品后,每份樣品各取0.5 g,加1 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液后用組織研磨儀研磨5 min,再加入1 mL PBS振蕩混勻,4 ℃、5000 r/min離心30 min取全部上清用2 mol/L NaOH調pH為7.4,pH計測定pH。

1.2.6.2 樣品制備 采用外標法,向上述樣品中分別添加不同體積的工作溶液,制成不同加標濃度(50、100、200、300、600 μg/kg)的加標樣品。各濃度進行5個樣品平行試驗,計算回收率及變異系數(CV)。

1.2.7 四環素中毒小鼠模型的建立

1.2.7.1 小鼠適應性飼養 20只雄性小鼠,飼養于無菌環境,通風換氣良好,溫度18～22 ℃,濕度45%～65%,房間光線良好,自由覓食進水,自由活動。按照江蘇省農業科學院實驗動物中心實驗動物倫理委員會相關規定進行動物實驗。

1.2.7.2 模型建立 將20只小鼠隨機分為空白對照組和四環素造模組,每組各10只。四環素造模組每天腹腔注射劑量為0.2 g/kg體重的四環素標準品(溶于PBS溶液中),空白對照組每天腹腔注射等體積的PBS溶液,連續給藥4 d。停止給藥后無需禁食,第2 d 0.5 mL 20%烏拉坦腹腔注射麻醉,仰臥于解剖盤上,取肝臟、腎臟、肌肉。

1.2.7.3 動物組織處理方法 剪取肝臟、腎臟、肌肉各0.5 g,加1 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液后用組織研磨儀研磨5 min,再加入1 mL PBS 振蕩混勻,4 ℃、5000 r/min離心30 min后取上清液,用2 mol/L NaOH溶液調節pH為7.4,pH計測定pH。

1.2.8 液質聯用法(LC-MS)測定 依據國標方法GB/T 21317-2007,采用液質聯用儀測定樣本中四環素的含量。色譜柱為Inertsil C8-3(150 mm×2.1 mm),粒度5 μm;流動相:甲醇(4.1)+10 mmol/L三氟乙酸(4.15);流速:300 μL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:30 μL。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0統計軟件對實驗數據進行統計學處理,圖表繪制采用Graphpad Prism 5繪圖軟件,組間比較采用t檢驗。以P<0. 05為差異有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 抗原包被載體蛋白的選擇

將小分子抗原物質包被在酶標板上是建立競爭化學發光酶免疫測定法的一個關鍵步驟。當抗原分子量較小或者分子極性較強時,抗原分子往往不容易被包被在酶標板上,因此需要將小分子物質與大分子物質載體蛋白偶聯,制備可以用于包被固相載體的半抗原載體蛋白復合物,進而提高包被效率[17-18]。常用的與小分子物質偶聯的載體蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、雞卵白蛋白(OVA)、血藍蛋白(KLH)、多聚賴氨酸(poly-l-lysine,PLL)等[19]。

將四環素與不同載體蛋白進行偶聯,應用Bradford法對偶聯蛋白進行定量分析,計算各載體蛋白的偶聯效率。如圖1所示,BSA的偶聯效率為0.887 mg BSA/mg四環素,OVA的偶聯效率為0.777 mg OVA/mg四環素,KLH的偶聯效率為0.583 mg KLH/mg四環素。與BSA偶聯四環素的偶聯效率相比,OVA和KLH的偶連效率均較低,且差異極顯著(P<0.001)。由于BSA的偶聯效率較高,效果較好,所以選擇BSA作為偶聯載體蛋白。

圖1 不同載體蛋白偶聯效率Fig.1 The coupling efficiency of different carrier proteins注:***表示與BSA相比，差異極顯著，P<0.001。

2.2 CLEIA測定法反應條件的優化

按照如上1.2.3實驗方法在室溫(20 ℃)和37 ℃下振蕩反應20、30、60 min,不振蕩反應20、30、60 min,比較不同反應溫度、反應時間及振蕩條件下的標準曲線。如圖2所示,圖中左邊Y軸為0濃度背景值最大發光值RLUmax,右邊Y軸為RLUmax和靈敏度IC50的比值。在37 ℃振蕩反應30 min時,RLUmax最大、IC50值最小、RLUmax/IC50最大,此時的檢測范圍最廣、靈敏度最低。故反應條件為37 ℃,振蕩反應30 min。

圖2 CLEIA法測定TC體系振蕩、反應溫度及時間的影響Fig.2 The effect of oscillation,incubation temperature and time on TC detection by CLEIA注:A1～A3:20 ℃振蕩20、30、60 min;A4～A6:20 ℃不振蕩20、30、60 min;B1～B3:37 ℃振蕩20、30、60 min;B4～B6:37 ℃不振蕩20、30、60 min。

2.3 競爭化學發光酶免疫測定法(CLEIA)的建立

優化各參數后建立了檢測四環素的競爭化學發光酶免疫測定法(TC-CLEIA)。如圖3所示,其相關系數r為0.9998(Y=51.1479+21.2557lgX),檢測范圍為0.0259～95.9478 μg/L,檢測限為0.0133 μg/L,準確度為99.17%,靈敏度為0.7305 μg/L。當抗原濃度分別為1和10 μg/L時,其變異系數CV分別為5.12%和3.79%,表明該體系重復性良好。

圖3 CLEIA法測定TC標準曲線Fig.3 Standard curve of TC detection by CLEIA

2.4 競爭化學發光酶免疫測定法(CLEIA)交叉反應

將四環素、金霉素、土霉素等分別按照1.2.1實驗方法配制一系列濃度的標準溶液,計算IC50值及交叉反應率。檢測結果如表1所示,四環素與同族的金霉素、土霉素、強力霉素稍有交叉反應,且交叉反應率較高,而與其他氯霉素、青霉素的交叉反應率極低。

2.5 添加回收試驗

按照上述1.2.6方法,在空白豬肉(去除脂肪)、魚肉(去除骨頭)、雞肝中添加三個不同濃度的四環素工作溶液,分別用TC-CLEIA和LC-MS法進行回收率試驗。各濃度進行5個樣品平行試驗,結果見表2。可以看出四環素的回收率在92.56%～108.56%之間,變異系數<10%,實際檢測濃度與添加濃度接近。說明CLEIA檢測法的準確度及精密性良好。

表2 豬肉、魚肉、雞肝中四環素添加回收率試驗Table 2 Recovery test of TC addition in pork,fish and chicken liver

表1 CLEIA測定法檢測四環素與其他藥物的交叉反應性Table 1 The cross-reaction between TC and other drugs detected by CLEIA

圖4 TC的LC-MS譜圖Fig.4 LC-MS spectrum of TC

2.6 競爭化學發光酶免疫測定法(CLEIA)檢測四環素中毒小鼠各組織樣本

與空白對照組小鼠相比,四環素造模組小鼠腹腔內臟器官呈黃褐色,表面不光滑,質地較軟,肝臟體積明顯增大。用CLEIA測定法對空白對照組、四環素造模組小鼠的肝臟、腎臟、肌肉樣本進行檢測,結果如表3所示。在中毒小鼠肝、腎和肌肉中均能檢測到四環素,且殘留量按濃度大小依次為:腎臟>肝臟>肌肉。

表3 CLEIA測定法檢測四環素中毒小鼠各組織中四環素濃度(n=10)Table 3 The concentration of TC detected by CLEIA in tissues of TC-toxic mice model(n=10)

3 討論與結論

獸用抗生素殘留是食品安全的重大問題,其中四環素類抗生素的應用十分廣泛[20-21]。目前檢測四環素類抗生素殘留的方法有很多,李佩佩等[22]利用超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)法對水產品中四環素類藥物及其差向異構體進行了檢測,曹金博等[23]利用免疫分析技術檢測了多種動物食品中四環素類抗生素殘留,邵鈺秀等[24]利用電堆積毛細管電泳法檢測了牛奶、雞蛋、蜂蜜等食品中四環素類抗生素殘留[25],劉興泉等[26]采用高通量微生物法和HPLC法檢測了豬肉中四環素和磺胺類抗生素殘留,而本研究則采用化學發光和酶聯免疫反應相結合的技術來測定食品中四環素類的殘留,與其他檢測方法相比,本方法靈敏度高、線性范圍廣,檢測更加簡便快速。

本研究選擇適宜的偶聯載體蛋白,通過優化各反應條件,建立了一種測定四環素的競爭化學發光酶免疫測定法(TC-CLEIA)。檢測范圍為0.0259～95.9478 μg/L,檢測限為0.0133 μg/L,準確度為99.17%,靈敏度為0.7305 μg/L,變異系數<10%,對氯霉素、青霉素具有極低的交叉反應。在空白豬肉、魚肉、雞肝中添加三個不同濃度的四環素標準品時,檢測結果具有較高的準確度和重復性。該CLEIA檢測法簡便,檢測限低,準確度、重復性、特異性均很好,符合檢測要求。通過四環素中毒小鼠模型,檢驗了CLEIA法檢測生物體內四環素的能力。結果表明,小鼠模型的肝、腎和肌肉中四環素殘留量按濃度大小依次為:腎臟>肝臟>肌肉。因此,該CLEIA檢測法適用于動物源性食品中四環素殘留的檢測,當樣本容量較大時,可用該方法進行快速檢測。