血府逐瘀湯對血管緊張素Ⅱ誘導大鼠骨髓源內皮祖細胞衰老、遷移功能及miR-34a表達的影響

何 莉，劉 蕓2，張 瑤3，梁 昊，張秋雁，聶 娟，楊 漾，謝 輝

缺血性心臟病是由于冠狀動脈循環改變引起冠狀動脈血流和心肌需求之間不平衡而導致的心肌損害，其中以冠狀動脈粥樣硬化引起的冠狀動脈狹窄和閉塞為特征的冠心病(coronary artery disease， CAD)是其最常見類型，嚴重危害人類健康，盡管人們采取了各種現代化治療方法，如靜脈溶栓、抗血小板聚集、心臟介入等，其發病率和死亡率均仍居各類致死性疾病前列。CAD發生后，除疏通阻塞的冠狀動脈外，還可以通過血管新生產生側支循環實現“自我搭橋”，挽救更多的心肌，從而降低病死率[1-2]。作為血管內皮前體細胞的內皮祖細胞(EPCs)在血管新生中扮演著重要的角色[3]。然而，病理狀態下EPCs存在衰老現象，嚴重影響其增殖和功能[4]。因此，延緩EPCs衰老、促進EPCs的遷移是實現冠狀動脈阻塞后血管新生的關鍵環節。

活血化瘀是中醫學治療冠心病的根本大法，血府逐瘀湯又是活血化瘀的經典名方，大量臨床研究證實其具有較好的抗心肌缺血作用。研究發現血府逐瘀湯可誘導EPCs遷移至缺血區，促進血管新生，進而改善缺血區心肌缺血壞死[5]，這種作用可能是通過抗EPCs衰老而實現的。本實驗觀察血府逐瘀湯對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的大鼠骨髓源內皮祖細胞衰老、遷移功能及miR-34a表達的影響，探討血府逐瘀湯抗衰老的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物 取原代EPCs用的SD雄性大鼠40只，4周齡，體質量100 ～110 g，動物合格證：43004700025025。取血清用的SD雄性大鼠，40只，體質量250 ～280 g，動物合格證：43004700024153。以上動物均由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，湖南中醫藥大學實驗動物中心清潔級動物房飼養，飼養環境：溫度20～25 ℃，濕度55%～60%，通氣良好。

1.2 藥物 血府逐瘀湯出自王清任《醫林改錯》，組方：當歸三錢(9 g)，生地三錢(9 g)，桃仁四錢(12 g)，紅花三錢(9 g)，枳殼二錢(6 g)，赤芍二錢(6 g)，柴胡一錢(3 g)，甘草二錢(6 g)，桔梗一錢半(4.5 g)，川芎一錢半(4.5 g)，牛膝三錢(9 g)。藥材購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院。藥液制備：加10倍量水浸泡0.5 h，然后用電熱套加熱回流提取1 h，濾過；第2次加8倍量水，同法再煮1 h。合并兩次煎液，濃縮至含生藥量1.56 g/mL。

1.3 試劑 EGM-2培養基：美國LONZA公司(CC-4147)；青-鏈霉素：碧云天公司(ST488)；大鼠骨髓源淋巴細胞分離液：天津灝洋公司(LTS1083)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)：Hyclone公司(SH30256.01B)；DMEM高糖培養基：Hyclone公司(SH30023.01B)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)：BI公司(04-001-1A/B)；細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒：碧云天公司(C0602)；β-actin：美國proteintech公司(60008-1-Ig)；AngⅡ：阿拉丁公司(4474-91-3)；CD133一抗：美國Novus公司(NB120-16518)；CD34抗體：美國Santa Cruz公司(SC-7324-FITC)；CD”133二抗：美國CST公司(14705s)；mirVanaTMmiRNA 分離試劑盒：美國Life technologies公司(AM1556)；iRNA逆轉錄試劑盒：美國GeneCopoeia公司(QP014)。

1.4 儀器 超凈工作臺：北京亞泰(YT-CJ-2NB)公司；低速離心機：知信儀器(SL02)公司；二氧化碳培養箱：上海三藤儀器(DH-160I)公司；立體顯微鏡：上海光學儀器一廠(XTZ-D/E)公司；臺式冷凍離心機：德國eppendorf(TGL-18R)；熒光定量RCP儀：美國Thermo(PIKO REAL 96)；熒光PCR板：美國Thermo(SPL0960)；恒溫水浴箱：河南金博(HH-S2)公司；電泳儀：中國Bio-rad(164-5050)；轉膜儀：北京六一(DYCZ-40A)公司；磁力攪拌器：榮華(a85-1)公司。

1.5 大鼠骨髓源EPCs 的分離、培養 大鼠脫頸處死，浸泡在 75%乙醇里 15 min，移至消毒托盤內，將后肢去皮連同肌肉取下，放至玻璃培養皿內，無菌分離股骨、脛骨，將附著于骨頭上的肌肉剔除干凈，放至另一玻璃培養皿內，6 mL PBS 清洗3遍，將黏附肌肉清洗干凈，剪斷一端骨骺端，用注射器抽取 EGM-2 培養基 6 mL，將骨髓沖到離心管內，取大鼠骨髓淋巴細胞分離液 6 mL，使用 1 mL 槍頭吸取細胞懸液沿管壁傾斜 45°小心加至淋巴細胞分離液上，注意保持兩層間形成明顯界面，水平離心 2 000 r/min，離心 20 min。離心后管內分3層，培養基在上層，紅細胞、粒細胞以及其他雜質在下層，中層為淋巴細胞分離液，上、中層分界處有一以單個核細胞為主的云霧狀薄層，用槍頭小心插至云霧層，將此層細胞全部吸入到另一離心管中，并加入10 mL 培養液，輕輕吹打洗滌，1 000 r/min離心10 min。離心后去上清，底部沉淀即為單個核細胞，用培養基輕輕吹打混勻，制成細胞懸液，計數，將細胞懸液按1×106個/mL 濃度移入預先包被細胞纖維連接蛋白(fibronectin，FN)的培養瓶，置37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱內靜置培養，每 3 d換液 1 次。

1.6 EPCs的免疫熒光鑒定 細胞培養到第14天，使用胰蛋白酶對細胞進行消化，1 000 r/min離心5 min，收集細胞懸液，接種于預先放置爬片的培養板中，培養24 h；取出爬片，PBS清洗3次，將爬片用4%多聚甲醛固定30 min；PBS沖洗5 min×3次，5% tritonX-100通透37 ℃30 min；PBS沖洗5 min×3次；5% BSA封閉1 h；孵育一抗，滴加適當的一抗(CD34-FITC、CD133)，4 ℃過夜。同樣用PBS沖洗5 min×3次，滴加抗兔IgG標記熒光抗體200 L，在37 ℃下孵育90 min；PBS清洗5 min×3次，DAPI染核：DAPI工作液37 ℃孵育10 min；90%甘油封片，到熒光顯微鏡下觀察。

1.7 含藥血清制備 SD大鼠40只，適應性喂養1周，隨機分為空白血清組和血府逐瘀湯含藥血清組，每組20只，血府逐瘀湯含藥血清組按14 g/(kg·d)，即按70 kg成人體表面積(平均)換算，相當于成人用量的10倍劑量灌胃，空白血清組用等量生理鹽水，1次/日，連續7 d。于末次用藥后2 h，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，于4 ℃靜置2 h，1 500 r/min離心15 min，提取上清液為含藥血清，經56 ℃水浴中30 min進行滅活，0.22 m過濾器過濾除菌，放置-20 ℃保存備用，需要時用培養液配制成所需濃度的含藥血清。

1.8 AngⅡ誘導EPCs 衰老及分組 將EPCs培養至第10天，根據文獻資料[6]，將細胞培養在100 nmol/L 濃度AngⅡ的培養液中，誘發EPCs的衰老，利用細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒進行染色，驗證AngⅡ誘導EPCs衰老是否成功。同時，將上述EPCs隨機分為：正常組(不做處理)、模型組(15%對照組大鼠血清+100 nmoL AngⅡ處理)、5%含藥血清組(5%含藥血清+100 nmoL AngⅡ處理)、10%含藥血清組(10%含藥血清+100 nmoL AngⅡ處理)、15%含藥血清組(15%含藥血清+100 nmoL AngⅡ處理)、抑制劑組(miR-34a抑制劑+100 nmoL AngⅡ處理)，分別處理24 h、48 h、72 h后收集細胞。

1.9 β-半乳糖苷酶檢測EPCs衰老情況 細胞衰老染色試劑盒，以X-gal為底物，在衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下會生成深藍色產物，從而在光學顯微鏡下很容易觀察到變成藍色的表達β-半乳糖苷酶的細胞或組織。按該原理定性、定量測定EPCs衰老情況，普通光學顯微鏡下隨機選取每只5個視野觀察，計數100個細胞中衰老細胞數目，取其平均數。

1.10 Transwell小室對EPCs遷移能力進行檢測 在Transwell小室的下室鋪FN，先將EPCs使用無血清及生長因子的培養基進行饑餓培養24 h，去除血清的影響；胰酶消化細胞，用PBS洗一遍，用無血清培養基將EPCs重懸 ，調整密度至1×105個；取200 μL細胞懸液加入上室，下室按分組分別加入空白血清培養基、5%、10%、15%含藥血清培養基及miR-34a抑制劑培養基500 μL；常規培養18 h；用棉簽將上室內的細胞擦去，將下室的細胞進行DAPI染色，顯微鏡下計數。

1.11 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測miR-34a的表達 提取細胞miRNA：分別干預24 h、48 h、72 h后，按試劑盒說明提取各組細胞的總RNA。逆轉錄。引物的設計與合成：U6：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′rno-miR-34a-5p：TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT。PCR擴增：Template(反轉錄產物)1 L，Primer A(10 m)0.5 L，Primer B(10 m)0.5 L，PCR H2O 13 L，2X SYBGREEN PCR Master Mix 15 L。上機95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s，共40個循環。

2 結 果

2.1 免疫熒光鑒定 熒光顯微鏡下觀察，藍色為DAPI藍色染核(見圖1)，綠色為CD34熒光染色(見圖2)，紅色為CD133熒光染色(見圖3)，陽性染色為CD34-FITC綠色和CD133紅色熒光信號(見圖4)，陽性染色即為EPCs。

圖1 DAPI染核(×400)

圖2 CD34熒光染色(×400)

圖3 CD133熒光染色(×400)

圖4 CD34/CD133雙染(×400)

2.2 對EPCs衰老的影響 鏡下觀察，藍色即為衰老細胞。干預24 h、48 h、72 h與正常組比較，模型組EPCs衰老數量明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，miR-34a抑制劑組和5%含藥血清組、10%含藥血清組、15%含藥血清組EPCs衰老數量減少(P<0.01)；與miR-34a抑制劑組比較，5%含藥血清組、10%含藥血清組、15%含藥血清組EPCs衰老數量明顯增多(P<0.01)；與5%含藥血清組比較，10%含藥血清組、15%含藥血清組EPCs衰老數量明顯減少(P<0.01)；與10%含藥血清組比較，15%含藥血清組的EPCs衰老數量減少(P<0.01)。各組EPCs衰老數量在24 h、48 h、72 h這3個干預時間比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果表明，血府逐瘀湯含藥血清能延緩EPCs衰老，在3個不同干預時間點比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組不同時間EPCs衰老數量比較(±s) 單位： 個

與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01；與miR-34a抑制劑組比較，③P<0.01；與5%含藥血清組比較，④P<0.01；與10%含藥血清組比較，⑤P<0.01。

2.3 對EPCs遷移功能的影響 與正常組比較，模型組EPCs遷移數量明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，miR-34a抑制劑組、5%含藥血清組、10%含藥血清組、15%含藥血清組EPCs遷移數量明顯增多(P<0.01)；與miR-34a抑制劑組比較，5%含藥血清組、10%含藥血清組、15%含藥血清組EPCs遷移數量減少(P<0.01)；與5%含藥血清組比較，10%含藥血清組、15%含藥血清組EPCs遷移數量明顯增多(P<0.01)；與10%含藥血清組比較，15%含藥血清組EPCs遷移數量明顯增多(P<0.01)。3個劑量以15%含藥血清組對EPCs遷移作用效果最優。詳見表2。

表2 各組EPCs遷移數量比較 (±s) 單位：個

與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01；與miR-34a抑制劑組比較，③P<0.01；與5%含藥血清組比較，④P<0.01；與10%含藥血清組比較，⑤P<0.01。

2.4 對miR-34a表達的影響 與正常組比較，模型組中miR-34a表達量在3個不同干預時間均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，miR-34a抑制劑組和10%含藥血清組、15%含藥血清組中miR-34a的表達量在3個不同干預時間均降低(P<0.01)，5%含藥血清組在干預48 h、72 h顯著降低(P<0.01)；與miR-34a抑制劑組比較，5%含藥血清組、10%含藥血清組、15%含藥血清組中miR-34a表達量在3個不同干預時間均明顯升高(P<0.01)；與5%含藥血清組比較，10%含藥血清組、15%含藥血清組miR-34a表達量在3個不同干預時間均明顯降低(P<0.01)；與10%含藥血清組比較，15%含藥血清組在干預48 h顯著降低(P<0.01)；3個濃度中以15%含藥血清效果最佳，3組在不同干預時間點間比較多數差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組不同時間EPCs中miR-34a表達水平比較(±s)

與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01；與miR-34a抑制劑組比較，③P<0.01；與5%含藥血清組比較，④P<0.01；與10%含藥血清組比較，⑤P<0.01；與組內干預24 h比較，⑥P<0.01；與組內干預48 h比較，⑦P<0.05，⑧P<0.01。

3 討 論

EPCs 是血管內皮細胞的前體細胞，亦稱為成血管細胞，正常情況下大多處于休眠狀態，在生理或病理因素刺激下能從骨髓動員到外周血、在體內缺血組織中整合形成新生血管的前體細胞。外源EPCs治療冠心病已從基礎研究推廣至臨床，能明顯改善心肌梗死病人和介入手術病人的預后。EPCs具有分化、遷移、血管新生、修復功能，在冠心病的發生、發展中扮演著重要角色[7]。冠心病病人循環血中EPCs的數量下降了近50%，黏附、遷移能力受損，經過跟蹤隨訪，EPCs數量及功能下降病人的預后更差[8]。大部分正常細胞在盡其有限的分裂后，衰老現象也會接踵而來，衰老雖然并不意味著細胞的死亡，但它的蛋白以及基因的表達譜可能翻天覆地改變，以至于在遇到刺激后不能再分裂。老齡、吸煙、動脈粥樣硬化、高血糖等冠心病危險因素均可引起EPCs衰老，EPCs的衰老會使其增殖和功能受到影響，而冠心病病人多伴有以上危險因素，與EPCs衰老互為因果，形成惡性循環，阻礙血管新生，逐漸引起心血管領域學者的關注。

miR-34a屬于miR-34家族，其生物學功能主要有細胞周期阻滯、促進細胞衰老及誘導細胞凋亡、組織細胞遷移[9]。自miR-34a被發現就一直因其對各類細胞的衰老、凋亡增殖作用而備受關注[10]，許多細胞凋亡及衰老的研究就是以此作為突破點逐漸明確了某些疾病的發生機制及藥物的作用機制[11]。有研究發現細胞轉染miR-34a后，誘發細胞衰老[12-13]。

本課題組前期研究已證實，血府逐瘀湯可上調血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等血管新生因子的表達，促進心肌缺血區的血管新生[14-15]。本實驗通過原代培養大鼠骨髓源內皮祖細胞，使用AngⅡ誘導其衰老，觀察血府逐瘀湯對AngⅡ誘導的大鼠骨髓源內皮祖細胞、遷移功能及miR-34a表達的影響，結果表明：血府逐瘀湯能減輕內皮祖細胞的衰老，其機制可能與改善EPCs的遷移功能、下調miR-34a的表達有關。