正常鹽飲食狀態下醛固酮增多對大鼠心肌的影響及其機制研究

心肌纖維化是多種心血管疾病導致心臟擴大、衰竭的終末期表現，其主要病理表現為心肌細胞增殖、細胞外膠原蛋白過度沉積，病因十分復雜，相關調控機制受多種因素影響[1]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)是近年來國內外研究的熱點，而醛固酮作為RAAS中的關鍵效應分子，其在心肌纖維化的發生、發展中發揮著重要作用。許多研究發現，醛固酮不僅是一個可致多器官纖維化的活性因子，而且是一個促炎反應因子和促血管鈣化因子[2-4]，是獨立的心血管危險因素之一。本課題組前期研究發現，外源性醛固酮不僅可導致大鼠主動脈纖維化改變，同時有研究亦發現醛固酮增多可導致心肌纖維化[5]，但其可能涉及的分子途徑尚未完全明了。據此，本實驗擬在正常鹽飲食情況下觀察醛固酮增多對大鼠心肌的影響，并初步探討可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥品 8周齡雄性SD大鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。醛固酮購自Sigma公司，血清單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)放免試劑盒購自北京華英公司，MCP-1受體一抗購自北京博奧森公司，二抗購自北京中杉金橋公司。其余為進口或國產分析純試劑。

1.2 實驗分組及標本收集 16只雄性SD大鼠隨機分兩組，每組8只。 正常對照組：給予等量的生理鹽水肌內注射；醛固酮組：采用醛固酮皮下注射(20 μg/d)，常規飼養6周。稱重后2%戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，置入含有促凝劑的試管中，靜置析出血清，4℃離心10 min，分離血清，-70 ℃保存。摘取心臟，用冰生理鹽水沖洗后稱重，切除部分心肌組織，石蠟包埋用于染色。

1.3 心肌組織膠原Masson染色 取大鼠心肌組織石蠟塊，制作4 μm厚切片，常規脫蠟、水化、脫水，Masson復合染色液5 min，0.2%醋酸水溶液稍洗，5%磷鎢酸5～10 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次，亮綠染色液5 min，0.2%醋酸水洗2次，經脫水、透明、封片，在光鏡下觀察。

1.4 放射免疫法檢 測心肌組織和血清MCP-1的表達 取大鼠心肌組織和血清標本，送至北京華英生物研究所，采用放射免疫法檢測。

1.5 免疫組織化學法檢測心肌組織MCP-1受體的表達 取大鼠心肌組織石蠟塊，制作4 μm厚切片，常規脫蠟至水、抗原修復、封閉非特異性抗原、滴加一抗、滴加二抗、DAB顯色、蘇木素復染、鹽酸酒精分化、脫水、透明、中性樹膠封片，具體按說明書進行。

2 結 果

2.1 Masson染色 Masson染色觀察心肌組織膠原沉積，醛固酮組心肌細胞排列紊亂，細胞間質膠原蛋白明顯沉積。詳見圖1。

正常對照組 醛固酮組

注：藍色為膠原成分。

圖1大鼠心肌細胞Masson染色(×40)

2.2 大鼠血清MCP-1表達和心臟/體重比的變化 醛固酮組血清MCP-1的表達和心臟/體重比明顯高于正常組。詳見表1。

表1 大鼠血清MCP-1含量和心臟/體重比的比較(±s)

與正常組比較，①P<0.05，②P<0.01。

2.3 大鼠心肌組織MCP-1 受體表達的變化 免疫組化染色顯示，醛固酮組大鼠心肌組織MCP-1受體的表達明顯高于正常組。詳見圖2。

正常對照組 醛固酮組

注：棕色為陽性表達。

圖2大鼠心肌細胞MCP-1受體染色 (×100)

3 討 論

心肌纖維化是高血壓、心肌梗死及心肌病多種心血管疾病的終末期表現，其主要病理表現為心肌間質中成纖維細胞增殖，并轉化為肌成纖維細胞及細胞外基質的過度沉積[1]。臨床研究亦證實，醛固酮增多病人對比相同血壓水平的原發性高血壓病人，左心室肥厚及纖維化更明顯，心血管疾病發生概率更高[6]。提示醛固酮致心肌纖維化作用是獨立于高血壓的。因此，醛固酮單獨可引起血壓升高和心臟病變，并且在不依賴高鹽狀態下是獨立的心血管危險因素[4]。在正常鹽飲食或高鹽飲食狀態下單純給予醛固酮均可誘導心肌纖維化、心肌肥厚、炎性細胞浸潤及炎癥因子的表達[4-5，7]。外源性醛固酮還可誘導心肌成纖維細胞增殖，促進膠原蛋白合成[8]，而細胞增殖和細胞間質膠原蛋白的沉積是心血管纖維化過程中重要的病理條件。由此可見，醛固酮與心血管疾病密切相關，是重要的促纖維化物質，可能涉及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、NF-κB及轉化生長因子-β(TGF-β)/Smads等信號通路[9-10]。

本課題組前期研究亦發現對正常鹽飲食大鼠，采用外源性醛固酮干預6周后，大鼠心肌組織出現纖維化情況，組織學染色發現大鼠心肌細胞排列紊亂，細胞間質膠原蛋白明顯沉積，并且心臟/體重比明顯增加，提示心肌纖維化和心肌肥大，與國內學者研究[5]一致。同時，本研究發現醛固酮組大鼠血清MCP-1濃度明顯上升高，同時心肌組織MCP-1受體的表達明顯上調，提示醛固酮不僅可誘導心肌纖維化，還可促進大鼠體內炎癥反應的發生，可能是一個獨立的促炎癥反應因子。

基礎實驗發現炎癥因子如MCP-1表達與心肌梗死后心肌重構密切相關，炎癥細胞浸潤心肌組織如巨噬細胞、炎癥因子分泌亦相應增多，促進α-平滑肌肌動蛋白及肌成纖維形成，引起心肌重構[11-12]，用加參方干預可抑制炎癥因子表達，從而改善心肌重構。MCP-1是一種經典的炎癥細胞趨化因子，與MCP-1受體結合后，可通過絲裂原活化蛋白激酶和PI3K-蛋白激酶B(AKT)等信號轉導通路作用，激活多種炎癥細胞如單核細胞、巨噬細胞及淋巴細胞等，從而誘導各種炎癥細胞遷移、聚集，并分泌各種炎癥反應介質，如白介素、腫瘤壞死因子等，通過氧化應激等生物學效應，導致局部組織細胞增殖、膠原沉積等，并且炎癥反應貫穿心血管重構的始終[13-14]。

本實驗發現正常鹽飲食狀態下，單純給予醛固酮不僅可導致心肌組織纖維化，還可上調機體MCP-1及其受體的表達，提示醛固酮亦是促炎因子，通過促進體內炎癥反應可能是醛固酮致心肌纖維化的重要分子機制之一，這將為心肌纖維化的機制研究及防治提供新的思路和作用靶點。