腌制蒸煮豬肉切片冷藏期間色澤變化與氮的存在形式及氧化狀態的關系

(湖北安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003)

腌制是傳統的食品加工保鮮工藝,腌制肉制品是現代肉品加工中的重要環節[1]。它能夠使肉品呈現特有色澤,產生特有風味,改善肉的品質,延長貨架期[2]。肉制品的色澤是影響消費者購買的決定性因素,褪色容易給人一種腐敗的錯覺,褪色嚴重影響產品的外觀品質[3],降低產品的商品價值,甚至無法銷售,但由于生產工藝和貯藏條件等因素,蒸煮腌肉制品在冷藏期間褪色現象普遍存在,褪色是限制蒸煮肉制品發展的主要原因[4-5]。

有關腌制肉制品品質因素和貨架期的關系的研究較多,大多集中在微生物因素、貯藏溫度、貯藏時間、肉制品的質構特征和其他因素(包裝方式、pH、水分活度)等方面[6]。段紅敏[7]研究了包裝材料對醬鹵類低溫肉制品品質影響;王新惠等[8]研究了儲藏溫度對臘肉品質的影響;王梓昂[9]報道了基于預測微生物學理論對真空包裝醬牛肉進行貨架期預測;茍惠天等[10]報道了細胞凋亡酶在肉品成熟過程中對其嫩度影響;Mancini等[11]報道表明高pH可以維持蒸煮豬肉產品的粉紅色,而且可以延長冷藏期間產品紅色的保持時間。目前對影響腌制品肉品質的多因素的綜合研究還比較少。

本文通過主成分分析(PCA)法研究了豬肉切片的色澤、理化指標、游離氨基酸、生物胺和一些氧化指標,系統的了解了蒸煮腌制肉制品在冷藏期間的色澤變化同氮的存在形式及氧化狀態的關系,對有效改善蒸煮腌制肉制品褪色等方面提供了理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的豬肉 購于荊州市農貿市場,在實驗室按照食品衛生標準自制成西式蒸煮火腿切片;色胺(TRY)、腐胺(TUT)、尸胺(CAD)、酪胺(TYR)、苯乙胺(PHE)、亞精胺(SPD)、精胺(SPM)、游離氨基酸(FAA)、衍生丹黃酰氯(dansyl chloride) 標準品,美國Sigma公司;乙腈、正己烷 色譜純,天津科密歐化學試劑有限公司;丙酮、石油醚(沸程為30～60 ℃)、乙酸乙酯、NaNO2分析純,天津科密歐化學試劑有限公司;抗壞血酸鈉、磷酸鹽 食品純,國藥集團化學試劑有限公司。

18W/830熒光燈管 飛利浦照明股份有限公司;FSH-II型高速電動勻漿器 江蘇金壇市環宇科學儀器廠;Allegra X-30R多功能臺式離心機 美國Beckman公司;日立全自動氨基酸分析儀L-890 日本日立公司;旋轉蒸發儀N-1200B 日本EYELA東京理化;TU-1900紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;PURELAB classic系列純水機 英國ELGA;CENTER?337照度計 臺灣NORTHERN BANKER ART有限公司;TM-902C中心溫度計 南京萬達有限公司;CR 400便攜式色差儀(D65光源) 日本Minolta公司;Waters Alliance 2695高效液相色譜儀(UV檢測器:Waters 2487AgilentZORBAXXDB-C18柱,4.6 mm×250 mm,5 μm) 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 根據Dineen等[12]、孫衛青等[13]的方法加以改善制備蒸煮腌制豬肉切片,將從農貿市場購買的新鮮的原料豬肉剔除脂肪、筋膜和表面血污,用消毒后的菜刀將粗處理后的原料肉分割成1 cm×1 cm×5 cm左右的肉塊。按照每1 kg的肉加入NaNO2150 mg,抗壞血酸鈉400 mg和食鹽20 g的量配制腌制液,在用篩板孔徑10 nm的絞肉機絞碎的肉塊中加入10%腌制液,然后一起放入斬拌機中做成肉糜,用鋁箔袋真空包裝(1 kg/袋),放在(4±1) ℃下發色48 h后裝入容量為1.25 kg的火腿模具,(80±1) ℃水浴加熱50 min,中心溫度達到了72 ℃左右,然后將模板取出放置在(4±1) ℃下冷卻4 h。將火腿脫模切片后按照每袋25 g的量真空包裝。模擬超市西式蒸煮火腿切片冷藏櫥窗儲存環境,將樣品單層平鋪在控溫冰箱的隔板上,上面45 cm處固定2支熒光燈管,環境溫度為(8±1) ℃,在1000 lx光照強度下。取樣速凍在-80 ℃的冰箱直到實驗結束,同時在1、7、14、21、28和35 d的時候測定樣品表觀色澤和色素含量,所有的指標都重復測3次。

1.2.2 色澤參數的測定

1.2.2.1 色澤的測定 豬肉切片表觀色澤使用CR 400色差儀測定,先用標準板校對色差儀,用L*、a*、b*系統測定樣品色澤參數。

Hue=tan-1(b*/a*)

式(1)

C=(a*2+b*2)1/2

式(2)

1.2.2.2 水分、pH、鹽分及亞硝酸鹽含量的測定 水分的測定參照GB/T 5009.3-2010方法[14];pH的測定參照GB/T 9695.5-2008方法[15];鹽分的測定參照GB/T 12457-2008方法[16];亞硝酸鹽的測定參照GB/T 5009.33-2010方法[17]。

1.2.2.3 亞硝基血色原(NH)的測定 參照Hornsey[18]的方法并改善。在微弱紅光的暗室中,準確稱取碎肉樣品10 g,加入丙酮水溶液(40∶2.7,V/V)42.7 mL,在氮吹條件下攪拌均勻,密封后放在黑暗中靜置10 min,然后離心(3000 r/min,5 min,4 ℃),過濾后在540 nm處比色,亞硝基血紅素在540 nm吸光度乘以因子290為肉中亞硝基血紅素濃度。

NH(mg/kg)=A540×290

1.2.3 生物胺及游離氨基酸含量的測定

1.2.3.1 生物胺的測定 按照孫衛青[19]的方法測定,HPLC設備和液相條件:Waters Alliance 2695 Separationgs Module高效液相色譜系統,紫外檢測器:Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector;XDB-C18柱。柱溫為30 ℃;流速1.0 mL/min;注射體積為20 μL;檢測波長為254.8 nm;流動相為水和乙腈。

1.2.3.2 游離氨基酸的測定 按照孫衛青[5]的方法,將處理好的樣品用氨基酸自動分析儀檢測,除羥脯氨酸在440 nm處檢測外,其他的氨基酸都在570 nm處檢測。

1.2.4 蛋白質和脂肪氧化相關指標的測定

1.2.4.1 蛋白質(Pr)和非蛋白氮(NPN)含量的測定 按照孫衛青[19]的方法處理后,用自動凱式定氮儀測定。

1.2.4.2 蛋白質羰基衍生物(CARB)的測定 參考Agnès等[20]、Mercier等[21]的方法做適當修改。量取500 mL肌原纖維蛋白溶液(9 mg/mL)在7 mL離心管中,離心(4 ℃,2000×g,10 min)取沉淀物,其中一份加入2 mL HCl,另一份加入2 mL 0.2%(w/v)的DNPH,在室溫避光靜置1 h,在此期間每隔10 min振蕩一次,然后加入2 mL 10%沉淀羥基化蛋白反應物(TCA),離心(4 ℃,2000×g,10 min)取沉淀物,用2 mL乙醇和乙酸乙酯(1∶1,V/V)混合液洗沉淀,然后離心(4 ℃,2000×g,10 min)取沉淀,重復3次。加入2 mL 6 mol/L鹽酸胍(20 mmol/L PBS,pH6.5),溶解沉淀,水浴(37 ℃,15 min),離心后取上清液,用鹽酸胍溶液調零,HCl處理組(未加DNPH)為空白對照,在370 nm測定吸光值,結果以每毫克蛋白中羰基含量表示。

表1 豬肉切片冷藏期間色澤參數及其他品質指標的變化Table 1 Changes of color parameters and other quality indicators of pork slices during cold storage

蛋白羰基含量(nmol/mg prot)=(A×L/22000×L×C)×D

式(3)

式中:A為吸光值;C為蛋白質濃度,mg/L;L為光程,1 cm;D為稀釋倍數;22000為蛋白質吸收系數,L/(mol·cm)。

1.2.4.3 游離巰基(SH)的測定 參考Agnès 等[20]的方法。準確稱取碎肉樣品10 g,加入含8 mol/L尿素的100 nmol/L PBS(pH為8)20 mL,冰浴勻漿4×10 s,靜置30 min,然后離心(10000×g,10 min,4 ℃)取上清液,加入1 mL蛋白質溶液到10 μL的10 mmol/L DTNP(2,2′-二硫代雙吡啶(2,2′-dithiobis)),在室溫下反應1 h后在386 nm處測其吸光度,空白樣用不含DTNP的同樣濃度的蛋白質,減去稀釋的DTNP的吸光度。

式(4)

式中:C為蛋白質濃度,mg/L;A為處吸光值;D為稀釋倍數;ε為摩爾消光系數,13600 L(mol·cm);L為光程,1 cm。

1.2.4.4 脂肪氧化形成的羰基值(FCARB)和雙烯值(DV)的測定 脂質的提取參考Folch等[22]的方法。取樣品8 g剪碎,然后加入甲烷-甲醇混合物(2∶1,V/V)溶液,在冰浴的條件下勻漿(4000 r/min,60 s),靜置后過濾,按照1∶0.22加入NaCl(0.73%)和CaCl2(0.04%)混合溶液(W/V),離心(3000 r/min,5 min,4 ℃),除去上層及膜狀雜質后將下層液體放入燒瓶中,在旋轉蒸發儀上抽真空(40 r/min),同時45 ℃水浴,得到純品油脂。用環己烷溶解得到的油脂,稀釋到200 μg/mL,并在215、232、275 nm處測定其吸光度。環己烷作為空白對照組。

式(5)

式(6)

1.2.4.5 抑制羥自由基能力(IC·OH)的測定 采用IC·OH試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)測定。

1.3 數據處理

結果表示為均值±標準偏差;利用SPSS 19.0軟件對樣品西式蒸煮火腿切片測得的理化指標,生物胺指標和游離氨基酸指標進行主成分分析(PCA)。

2 結果與討論

2.1 豬肉切片冷藏期間色澤參數變化

從表1可知,豬肉切片在冷藏期間在第1～7 d除了Hue外,其他品質指標均發生顯著性變化(P<0.05),其中L*、b*和Hue在第7～35 d期間無顯著性變化。a*、C和NH隨著貯藏時間增加而顯著性降低,b*和Hue的變化無穩定規律,通常情況下肉類在貯藏過程中Hue會因b*的無規律變化而無法得到穩定變化趨勢[23];在冷藏期間水分在第7～21 d貯藏期間無顯著性變化,在第28～35 d顯著性降低,可能是樣品水樣在儲藏期間有一個重新平衡的過程,初期肉樣吸收周圍的水分,含量升高,中后期肉樣發生部分脫水,水分降低[24]。NaNO2和NH在冷藏期間顯著性降低,亞硝酸鈉與肉中的乳酸反應生成亞硝酸,亞硝酸不穩定分解成亞硝基,亞硝基進一步生成亞硝基肌紅蛋白和亞硝基血紅蛋白[25-26]。pH在貯藏期間變化顯著變化,但是變化趨勢不穩定,后期快速降低可能與樣品中微生物菌相有關[13]。

2.2 豬肉切片冷藏期間生物胺和游離氨基酸的變化

食品中微生物的活動產生的脫羧酶催化氨基酸脫羧產生生物胺,不同的食品和微生物的存在狀態也會造成不同胺的產生量的不同[27],因此,有些學者將生物胺作為判斷食品腐敗的指標[28]。從表2中可以看出,8種生物胺和游離氨基酸在冷藏期間,色胺(TRY)、苯乙胺(PHE)、尸胺(CAD)和游離氨基酸總和(∑FAA)整體上無顯著性變化(P<0.05),本實驗中1～28 d未檢測出組胺,在35 d檢測出組胺,可能是前期組胺含量較低,未檢測出。第1 d時，在生物胺中,精胺(SPM)的含量最高,其次是苯乙胺(PHE)、色胺(TRY)、組胺(HIS)和腐胺(PUT),此外還含有少量的尸胺(CAD)、酪胺(TYR)和亞精胺(SPD)。有研究報道稱在鮮肉中精胺和色胺本身的含量比較高[29-30]。但是本實驗中苯乙胺在1～7 d含量比色胺還高,可能是真空包裝肉制品中的優勢菌為乳酸菌[31],因為多數彎曲乳桿菌會產生β-苯乙胺[32]。食品中生物胺的含量受多種因素影響,如體系中可利用游離氨基酸濃度、微生物脫羧酶的活性、pH、離子強度以及加工貯藏條件[33],這可能是本實驗與其他研究報道存在差異的主要原因。

表2 豬肉切片冷藏期間生物胺和游離氨基酸的變化(mg/kg)Table 2 Changes of biogenic amines and free amino acids during cold storage of pork slices(mg/kg)

表3 豬肉切片冷藏期間蛋白質和脂肪氧化的變化Table 3 Changes of protein and fat oxidation during pork storage

2.3 豬肉切片冷藏期間蛋白質和脂肪氧化的變化

從表3中可以看出,在蛋白質和脂肪氧化中,除了Pr和IC·OH無顯著性變化外,其他的都有顯著性變化(P<0.05)。CARB和DV在儲藏期間增加,肌細胞蛋白很容易受到氧化,主要由脂質的過氧化產生的活性氧和自由基攻擊或由金屬或酶催化反應引發,從而導致蛋白功能性質和肉品品質的變化。SH在冷藏期間減少,SH具有較強的還原力,在冷藏期間脂質和蛋白的氧化,體系的氧化力增加,SH含量降低[34]。其中DV和FCARB在冷藏期間的變化趨勢都是第1～14 d增加,在14～21 d減少。

2.4 豬肉切片冷藏期間色澤與氮的存在形式和氧化狀態的因子分析

利用SPSS 19.0軟件對自制的豬肉切片冷藏期間的色澤和一些理化指標、生物胺的含量和16種游離氨基酸之和進行主成分分析(PCA)。將這些指標進行主成分分析后,得到3個公共因子如表4,因子1和因子2對樣本的方差累計貢獻率達到87.343%,可以反映所有因素包含的信息,因此下面對因子1和因子2進行分析。

表4 因子分析提取主成分解釋的總方差Table 4 Factor analysis extracts the total variance of principal component interpretation

從表5可以看出,因子1(F1)中,與色澤相關的因子紅度a*、色調Hue、色飽和度C、亞硝基血色原NH、亞硝酸鈉、水分、巰基SH和游離氨基酸總和∑FAA的系數絕對值都在0.90以上,其次是黃度b*、pH和共軛二烯值DV的系數絕對值也比較高,分別為0.886、-0.872和-0.825。鮮肉及肉制品色澤受許多因素影響,如肉的pH、色素含量、氧化還原潛力、腌制劑的擴散、溫度、水分等[35]。亞硝酸鹽反應生成的NO與肌肉中的肌紅蛋白反應有關,這一反應也與肌肉色澤有關[27]。由此可以發現因子1(F1)與色澤內環境和氮的存在形式有密切關系。因子2(F2)主要由蛋白含量(Pr)、抑制羥基自由基能力(IC·OH)和酪胺(TYR)這3個指標所決定的,這3個指標的旋轉成分矩陣值都在0.8以上,其中蛋白含量(Pr)和抑制羥基自由基能力(IC·OH)同豬肉切片的氧化狀態有關。F2與豬肉切片的氧化狀態有關。

表5 旋轉成份矩陣Table 5 Rotation component matrix

從圖1中可以看出,生物胺和游離氨基酸之和在因子1(F1)和因子(F2)平面散點圖上面的分布比較分散,說明豬肉切片各類含氮化合物之間可能有關聯,但不是直接相關。NH、紅度a*、黃度b*、亮度L、色飽和度C和亞硝酸鈉NaNO2在因子1(F1)的右邊,游離氨基酸總和ΣFAA、pH、水分和色調Hue在因子1(F1)的左邊,并且紅度a*和這些都與因子1(F1)有密切的關聯,說明因子1(F1)代表了豬肉切片的色澤內環境,并且紅度a*和游離氨基酸總和ΣFAA在F1上面的位置相對,說明游離氨基酸總和ΣFAA 直接影響到了豬肉切片儲藏期間的紅度,可能是游離氨基酸總和ΣFAA或者個別游離氨基酸通過影響環境體系的酸堿度,或者通過影響亮度L*和黃度b*,間接影響表觀紅[13],而且紅度a*和NH兩個因素之間的相對距離最近,說明NH的變化直接影響到產品表觀紅度,因為亞硝基血色原體是非常穩定的鮮紅色[6],這與表1表達的信息是一致的。在因子2(F2)中非蛋白氮(NPN)、抑制羥自由基能力(IC·OH)、蛋白含量(Pr)、和色胺(TYR)上系數絕對值比較大,并且抑制羥自由基能力(IC·OH)和蛋白含量(Pr)呈極顯著負相關,可能是在自由基氧化的攻擊下,蛋白質的三級結構會發生變化,導致疏水集團暴露,表面疏水性增加,從而蛋白質-水分子的作用力減少,此外,蛋白質交聯形成的聚合物也會削弱蛋白與溶劑相互作用綜合可以看出F(2)反映出蛋白質的氧化情況,羥自由基普遍存在肉制品儲藏過程中,并且會進一步影響蛋白的氧化。

圖1 旋轉空間中的成分圖Fig.1 Composition diagram in the rotating space

3 結論

腌制蒸煮豬肉切片在冷藏期間褪色顯著,亮度L*、紅度a*、黃度b*、色調Hue、色飽和度C和亞硝基血色原NH均發生了顯著性變化,生物胺中酪胺(TYR)、亞精胺(SPD)和精胺(SPM)發生顯著性變化,游離氨基酸之和在冷藏期間無顯著性變化;非蛋白氮(NPN)、羰基(CARB)和共軛二烯值(DV)發生顯著性變化,冷藏期間腌制蒸煮豬肉切片的蛋白質和脂肪受到較大影響。通過因子分析,可以發現,色澤內環境和氮的存在形式有相關性。其中游離氨基酸之和只跟色調Hue正相關,與其他色澤指標呈顯著負相關;生物胺中,除了色胺(TRY)與亮度L*呈顯著負相關外,其他生物胺與色澤無顯著相關。