N、S改性TiO2及其與淀粉復合膜的抑菌性能及保鮮效果

黃卓林,張 靜,宋賢良

(華南農業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642)

我國的果蔬種植面積和產量均居世界之首。但是由于儲運保鮮技術不完善,我國每年果蔬損失超過25%[1]。果蔬腐爛是造成其損失的重要原因,主要包括生理[2]、微生物[3]和化學[4]三方面。目前廣泛采用的果蔬貯藏技術有低溫貯藏法、氣調貯藏法、輻射貯藏法、生物技術保鮮、微生物拮抗保鮮、臭氧離子貯藏法及涂膜劑保鮮法等[5-6]。上述方法主要是通過抑制微生物及酶的活性進而延長果蔬的保鮮期。其中,以淀粉為原料的涂膜保鮮法具有方法簡便、成本低、綠色環(huán)保等優(yōu)勢[7-9],并且涂膜層具有較好的選擇透氣性、阻水性,在一定程度上可以抑制采后水果在貯藏過程中的呼吸作用和蒸騰作用,減少果蔬自身營養(yǎng)物質的消耗和水分的減少。

淀粉是微生物繁殖的天然培養(yǎng)基,因此需添加適宜的抑菌材料增強淀粉膜的抗菌性能[10]。以TiO2為代表的半導體光催化抑菌材料具有安全、穩(wěn)定性好[11]、廣譜抗菌、可重復利用等優(yōu)點[12-13],但因其帶隙較寬,只能在紫外光照射的條件下才能被激發(fā)[14-15]。非金屬元素摻雜改性納米TiO2不僅克服了其寬帶隙的缺點,將TiO2的光響應范圍拓寬到可見光區(qū)域[6],同時也可以改善淀粉膜的機械性能[16-17]。目前采用N、S改性納米TiO2與淀粉復合構筑具有抗菌和保鮮功能的復合膜的研究尚未見有報道。

本文采用非金屬元素N、S對納米TiO2進行改性得到N-TiO2和S-TiO2可見光催化材料,并將改性后的光催化材料通過內部摻雜法負載到淀粉膜上,得到N、S改性TiO2/淀粉復合膜。研究粉體光催化材料及其淀粉復合膜對大腸桿菌的抑菌效果以及復合涂膜對圣女果的保鮮作用,以期為新型涂膜保鮮材料的研究開發(fā)提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(O78) 由華南農業(yè)大學微生物實驗室提供;納米TiO2粉(平均粒徑21 nm) 德國Degussa公司;玉米淀粉(食品級) 黃龍食品工業(yè)有限公司;圣女果 超市(廣州五山);氯化鈉、氫氧化鈉、草酸、脲、硫脲、乙醇、Tris堿干粉、乙酸、乙二胺四乙酸以及配制LB固體培養(yǎng)基所需的瓊脂粉、酵母浸膏、胰蛋白胨等 均為國產分析純。

D8 ADVANCE型X射線多晶衍射儀 德國Bruker公司;XL-30-ESEM型環(huán)境掃描電子顯微鏡 荷蘭FEI公司;VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司;752N紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;SW-CJ-IFD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;E27-白光6400K85W國能三基色節(jié)能燈 普王科技照明電器廠;DX-35BI座式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;JJ-2組織搗碎勻漿機 金壇市恒豐儀器廠;FZ-A型輻照計 北京師范大學光電儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 N、S摻雜改性TiO2材料的制備 稱取兩份2 g的TiO2粉末分別與8 g脲和5.7 g硫脲粉末混合,用瑪瑙研缽充分研磨后在400 ℃的馬弗爐中煅燒3 h,冷卻、研磨后,得N-TiO2和S-TiO2粉末。將制備的N-TiO2和S-TiO2粉末進行XRD與FTIR測試。

1.2.2 表征方法 通過X-射線衍射(XRD)、傅里葉紅外光譜(FTIR)等技術表征TiO2、N-TiO2和S-TiO2的晶型結構和化學鍵。

1.2.2.1 XRD測試條件 Cu靶,Kα射線,λ=0.15405 nm,掃描速度5 °/min,掃描范圍2θ=20°～90°,管電壓為40 kV,管電流30 mA。

1.2.2.2 晶粒尺寸計算 根據XRD分析結果并通過Scherrer公式晶體尺寸對TiO2、N-TiO2和S-TiO2的晶粒尺寸(D)進行估算。

式中:D為晶粒垂直于晶面方向的平均厚度(nm)；β為樣品衍射峰半高寬度；θ為衍射角；λ為X射線波長。

1.2.2.3 FTIR測試條件 將干燥后的待測樣品與KBr粉末混合均勻后壓片,置于樣品架中,以空氣為背景,掃描范圍為400～4000 cm-1,分辨率為2 cm-1。

1.2.3 淀粉復合膜的制備 淀粉復合膜的制備參照宋賢良等[12]的方法:在50 mL蒸餾水中分別加入0.3 g的TiO2、N-TiO2和S-TiO2粉末,超聲波分散30 min后得到A液;在50 mL蒸餾水中加入5 g的玉米淀粉和0.3 g的卡拉膠,攪拌分散均勻后得B液;將A、B液混合后加入1.6 g的甘油為增塑劑。在85 ℃條件下水浴攪拌加熱15 min至糊化;流延法涂膜(12 cm×10 cm的玻璃模板)后置于50 ℃的烘箱中干燥,取出自然冷卻8～12 h,揭膜后裁成直徑為1.5 cm的圓片,紫外燈下滅菌30 min后備用。

1.2.4 TiO2、N-TiO2、S-TiO2光催化抑制大腸桿菌實驗 無菌條件下,在8 mL生理鹽水的試管中加入1 mL濃度為105CFU/mL的大腸桿菌菌懸液,再分別加入1 mL濃度為10 g/L的TiO2、N-TiO2、S-TiO2懸濁液為樣品組,以加入1 mL蒸餾水的試管作為空白組,黑暗處理的為無光照組。用渦流振蕩器將材料和菌液混合均勻,然后轉移至帶有普通熒光燈的反應器中,控制光源距反應器中液面的距離為8 cm(實際測得光照強度4.40 mW/cm2)。每20 min取樣100 μL,涂布培養(yǎng),3次重復,18 h后計數、拍照并計算抑菌率。將光照反應100 min后的大腸桿菌菌液經離心、固定、漂洗、脫水、干燥、噴金等處理后置于掃描電鏡下觀察(加速電壓為20 kV)。

1.2.5 淀粉復合膜抑制大腸桿菌實驗 無菌條件下取100 μL濃度約為105CFU/mL的大腸桿菌懸液至LB固體培養(yǎng)基上,涂布均勻。將1.2.3中制備得到的TiO2、N-TiO2和S-TiO2/淀粉復合膜貼在已涂布大腸桿菌的培養(yǎng)基后,開始光照處理,每隔一段時間將平板取出倒置于生化培養(yǎng)箱中37 ℃黑暗培養(yǎng)(間隔取樣時間為:第1 h內30 min/次,其余時間1 h/次),待菌落長出后測量抑菌圈的直徑并對實驗終點的抑菌情況進行拍照。

1.2.6 圣女果保鮮涂膜 按照1.2.3中淀粉復合膜的制備方法分別制備TiO2、N-TiO2和S-TiO2的涂膜液,加熱糊化后冷卻備用。

挑選市售的無機械損傷、無病蟲害、大小均勻、成熟度基本一致的圣女果,洗凈、擦干。將干燥潔凈的圣女果放入上述涂膜液中,圣女果表面被膜液均勻涂布后撈出,室溫下晾干。根據涂膜液的不同,將圣女果分為TiO2組、N-TiO2組和S-TiO2組,無膜組不進行任何涂膜處理,空白膜組為涂膜液中只含玉米淀粉、卡拉膠和甘油。將無膜組和涂膜處理后的圣女果放入培養(yǎng)箱(27±2 ℃)中光照處理。測定涂膜圣女果在8 d內失重率、腐爛率、維生素C含量、總酸含量以及總糖含量的變化。

1.2.8 腐爛率測定 分別記錄貯藏第1 d圣女果數量n0與不同貯藏時間內的爛果(觀察圣女果霉變、病變、腐爛情況,全果可食部分少于4/5時為爛果)數量nt,按下式求出腐爛率。

1.2.9 失重率測定 測定每一個樣品在取樣時間的重量mt(g)以及初始質量m0(g),按下式計算失重率。

1.2.10 維生素C含量的測定 參照GB 5009.86-2016《食品安全國家標準食品中抗壞血酸的測定》[18]。

1.2.11 總酸含量的測定 參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》[19]。

1.2.12 總糖含量的測定 圣女果中總糖含量的測定采用DNS比色法。其中,葡萄糖標準曲線的繪制按田曉菊[20]的方法,所測得曲線為y=1.632X-0.0026,R2=0.9999。

樣品預處理:準確稱取2 g圣女果果漿,放入250 mL三角瓶中,加15 mL蒸餾水及10 mL 6 mol/L的鹽酸,置于70 ℃恒溫水浴中水解30 min。待三角瓶中的水解液冷卻后過濾,加入2～3滴酚酞指示劑至濾液中,用6 mol/L的NaOH中和至微紅色,用蒸餾水定容在200 mL容量瓶中,混勻,作為總糖待測液。

參照GB 5009.7-2016《食品安全國家標準食品中還原糖含量的測定》中的方法測定還原糖含量。

1.3 數據處理

每組實驗重復三次,使用Jade 6.5對樣品的X射線衍射圖譜進行分析,使用Origin 9.1處理實驗數據及繪圖。

2 結果與分析

2.1 X射線衍射分析

圖1是TiO2、N-TiO2和S-TiO2的XRD分析結果,與標準品對比,TiO2、N-TiO2和S-TiO2在2θ=25.28°、48.05°以及55.06°分別出現明顯的二氧化鈦銳鈦礦特征衍射峰,在2θ=27.54°、36.06°、41.32°以及54.28°出現金紅石相的特征衍射峰,表明樣品由銳鈦礦相和金紅石相組成。N-TiO2和S-TiO2的XRD并沒有出現N和S元素的特征衍射峰,這表明N和S摻雜并不會引起TiO2晶體結構的改變[21]。與TiO2相比,N-TiO2和S-TiO2的衍射峰強度有所下降,且衍射峰位置有所移動,表明N、S元素摻雜進入TiO2中[22]。按1.2.2.2中方法測得TiO2、N-TiO2和S-TiO2晶粒尺寸分別為19.6、23.3和25.8 nm,改性后的N-TiO2和S-TiO2晶粒尺寸有所增大。這是因為在煅燒過程N、S摻雜進入TiO2的晶格,產生了晶格膨脹進而導致晶粒尺寸增大[23]。

圖1 TiO2、N-TiO2和S-TiO2的X射線衍射圖譜Fig.1 X-ray diffraction(XRD)patterns of TiO2,N-TiO2and S-TiO2

2.2 傅里葉紅外光譜分析

圖2為TiO2、N-TiO2和S-TiO2的傅里葉紅外圖譜。三種樣品在1000 cm-1以下出現的吸收峰為TiO2晶體中Ti-O的特征振動峰,在1630與3450 cm-1處分別出現歸屬于水分子中-OH的彎曲振動峰以及與鈦原子相連的-OH的伸縮振動峰。N-TiO2樣品中在1401 cm-1處出現N-H的彎曲振動峰,這可能是由于樣品中摻雜的N與表面吸附的水所造成[24]。S-TiO2在1053和1406 cm-1處分別出現O-S的伸縮振動峰和S=O的不對稱伸縮振動峰[25];在1200 cm-1處出現的C-O的彎曲振動峰,這可能是樣品制備中硫脲造成的。

圖2 TiO2、N-TiO2和S-TiO2的傅里葉紅外圖譜Fig.2 FTIR spectra of TiO2,N-TiO2and S-TiO2

2.3 TiO2、N-TiO2和S-TiO2對大腸桿菌的抑制效果

圖3 TiO2、N-TiO2和S-TiO2對大腸桿菌的抑制效果Fig.3 Inhibition effect of TiO2,N-TiO2and S-TiO2 on E.coli

圖4 TiO2、N-TiO2和S-TiO2對大腸桿菌抑菌率的影響Fig.4 Effect of TiO2,N-TiO2 and S-TiO2 on the antibacterial rate of E.coli

2.4 N、S改性TiO2材料光照處理后的大腸桿菌形態(tài)觀察

對不同材料光照處理100 min后的大腸桿菌表面微觀結構進行觀察。空白組的大腸桿菌呈完整的桿狀,表面光滑(圖5a)。TiO2光照處理后的大腸桿菌表面粗糙,菌體皺縮,這是納米TiO2顆粒附著在大腸桿菌表面所造成的(圖5b)。經N-TiO2和S-TiO2光照處理后的大腸桿菌無完整形態(tài),破損的菌體表面布滿納米材料顆粒。這表明光催化反應可以破壞大腸桿菌的生理活動,導致其失活,同時也證明了改性后的材料具有比TiO2更好的抑菌性能。

圖5 不同材料光照處理后大腸桿菌的形態(tài)Fig.5 Morphology of E.coli after irradiation with different materials注a:空白組;b:TiO2組;c:N-TiO2組;d:S-TiO2組。

2.5 N、S改性TiO2/淀粉復合膜對大腸桿菌的抑制效果

圖6為光照5 h不同淀粉復合膜對大腸桿菌的抑制效果,可以觀察到這三種復合膜都沒有形成明顯的抑菌圈,這可能與復合材料無法在培養(yǎng)基上擴散有關。但是從圖7可看出TiO2、N-TiO2和S-TiO2/淀粉復合膜上的大腸桿菌菌落數隨光照時間的延長而迅速減少,當光照時間達到2 h后,三種復合膜上的菌落數逐漸接近于0。在光照時間2 h內,N-TiO2和S-TiO2/淀粉復合膜上菌落數少于TiO2/淀粉復合膜,這表明使用非金屬元素N和S改性后的N-TiO2和S-TiO2/淀粉復合膜的抑菌能力強于TiO2/淀粉復合膜。

圖6 TiO2、N-TiO2和S-TiO2/淀粉復合膜對大腸桿菌的抑制效果Fig.6 Antibacterial effect of TiO2,N-TiO2 and S-TiO2/starch composite films on E.coli

圖7 TiO2、N-TiO2和S-TiO2/淀粉復合膜對大腸桿菌的抑制效果Fig.7 Antibacterial effect of TiO2,N-TiO2 and S-TiO2/starch composite films on E.coli

2.6 改性TiO2/淀粉復合涂膜對圣女果保鮮效果的影響

2.6.1 改性TiO2/淀粉復合涂膜對圣女果腐爛率的影響 采后果蔬在貯藏過程中會由于呼吸作用和蒸發(fā)作用引起自身水分損失,使得果實組織細胞失去原有的飽滿狀態(tài),呈現萎蔫、疲軟的形態(tài),進而更容易遭受微生物的侵染而逐漸腐爛。由圖7可看出,空白的淀粉膜具有抑制圣女果腐爛的作用,因為淀粉膜可以隔絕環(huán)境中微生物對圣女果的侵染。在光照下TiO2具有抑菌作用,因此添加TiO2粉體可以改善復合膜的抑菌性能。此外,添加一定量的TiO2粉體可以改善復合膜的物理性能,降低膜的透濕性和透氣性,阻擋外部環(huán)境中微生物對圣女果的侵染作用[30]。經過改性后的N-TiO2和S-TiO2抑菌性能進一步增強,因此可以將圣女果的腐爛率抑制在較低的水平。其中S-TiO2/淀粉復合膜對圣女果的腐爛率抑制效果最好,相比無膜組,S-TiO2/淀粉復合膜對圣女果的腐爛率降低了6.25%。這可能是因為S-TiO2提高了光能利用率,產生了更多的超氧自由基和羥基自由基用以抑制微生物的活性[13,26]。

圖8 不同復合淀粉膜對圣女果腐爛率的影響Fig.8 Effect of different composite starch films on the decay rates of cherry tomato

2.6.2 改性TiO2/淀粉復合涂膜對圣女果失重率的影響 新鮮果蔬都含有大量的水分和營養(yǎng)物質,隨著果蔬成熟度的增加,果蔬內部的水分和營養(yǎng)物質會逐漸消耗,進而導致其質量減少[31]。從圖7中可以看出,隨著貯藏天數的增加,圣女果的失重率逐漸上升。其中,在貯藏的5 d后,相比于涂膜處理組,無膜組圣女果的失重率的快速上升。這說明涂膜處理能夠抑制圣女果的水分和營養(yǎng)物質散失,使失重率較無涂膜處理的低。在復合涂膜中添加TiO2及改性后的N-TiO2和S-TiO2,圣女果的失重率進一步得到改善。這是因為添加適量的改性TiO2材料有助于淀粉分子間羥基的締合并形成網狀結構,從而減少了淀粉膜中的親水基團,進而增強了復合膜的阻水性能[31],使涂膜圣女果的水分散失減少,從而抑制了失重率的升高。

圖9 不同復合淀粉膜對圣女果失重率的影響Fig.9 Effect of different composite starch films on weight loss rates of cherry tomato

2.6.3 改性TiO2/淀粉復合涂膜對圣女果維生素C含量的影響 新鮮水果中富含維生素C(VC),作為一種高效的抗氧化劑,VC是衡量水果營養(yǎng)價值的重要指標。但是VC在貯藏過程中極易發(fā)生降解,所以常用VC含量損失率來評價水果的品質。圖10是儲存過程中VC含量的變化情況,經過8 d的貯藏,無膜組的VC含量為5.03 mg/100 g,而涂膜組的VC含量均高于5.34 mg/100 g。這說明涂膜處理可以延緩貯藏期間圣女果VC含量的損失。與空白淀粉膜相比,添加N-TiO2、S-TiO2涂膜的圣女果VC含量在貯藏后期依然較高。其原因是添加適量的復合材料降低了淀粉膜的透氣性,抑制了淀粉膜內外的氣體交換,造成淀粉膜內O2含量減少,CO2含量升高,減緩了VC的氧化[13];另一方面,涂膜處理造成淀粉膜內低O2分壓減弱了圣女果的呼吸作用[33],使其所消耗的VC減少。但是,相對于只添加了TiO2的復合膜,N-TiO2/淀粉復合膜對VC含量降低的抑制作用并不明顯。其原因可能是改性N-TiO2粒徑有所增大,從而影響了淀粉膜的阻氣性能。

圖10 不同淀粉復合膜對圣女果VC含量的影響Fig.10 Effect of different composite starch films on VC contents of cherry tomato

2.6.4 改性TiO2/淀粉復合涂膜對圣女果總酸含量的影響 在圣女果貯藏過程中,其內部有機酸會逐漸轉化成可溶性糖,所以其總酸含量會不斷降低。圖10是不同淀粉復合膜對圣女果總酸含量的影響。無膜組在貯藏8 d后總酸含量為5.02%,涂膜處理后的圣女果總酸含量均高于5.30%,說明涂膜處理可以抑制貯藏期內圣女果總酸含量的降低。其中經S-TiO2淀粉涂膜的圣女果在8 d后總酸含量達到5.62%。改性后的N-TiO2/淀粉復合膜對圣女果總酸含量的降低的抑制作用反而不如TiO2/淀粉復合膜。這可能是改性N-TiO2粒徑有所增大[29],摻雜進淀粉膜后增大了淀粉網格的間隙,從而影響了淀粉膜的阻氣性能,進而造成儲存過程中圣女果的呼吸作用提升。

圖11 不同淀粉復合膜對圣女果總酸含量的影響Fig.11 Effect of different starch composite films on total acid content of cherry tomato

2.6.5 改性TiO2/淀粉復合涂膜對圣女果總糖含量的影響 糖分含量是影響水果營養(yǎng)價值和口感的重要因素,是水果甜味的主要來源。在貯藏過程中,圣女果的呼吸作用會消耗糖分,所以總糖含量逐漸減少。從圖11可以看出,涂膜處理可以抑制圣女果中總糖含量的降低。這是由于涂膜處理使淀粉膜內的O2分壓降低,從而可以抑制了圣女果的呼吸作用。但是,相較于TiO2復合涂膜,S-TiO2/淀粉涂膜和N-TiO2/淀粉涂膜對總糖含量降低的抑制作用有限,這可能是因為S-TiO2/淀粉涂膜和N-TiO2/淀粉涂膜可以有效抑制圣女果的失重率,使貯藏期內的圣女果的水分含量的降低速度低于總糖含量的降低速度,最終造成TiO2復合涂膜的圣女果總糖含量比N-TiO2和S-TiO2/淀粉涂膜的偏高。

圖12 不同淀粉復合膜對圣女果總糖含量的影響Fig.12 Effect of different starch composites films on the total sugar contents of cherry tomato

3 結論

以N、S元素對TiO2進行改性,XRD與FTIR分析表明:N、S元素摻雜進入TiO2中,使其局部發(fā)生微小畸變,但并未改變TiO2的晶型。改性后的N-TiO2、S-TiO2材料的光催化性能提高,因此光照下對大腸桿菌具有更好的抑制效果。與TiO2相比,N-TiO2、S-TiO2對大腸桿菌的抑制率分別提高了24%和30%。將改性后的S-TiO2、N-TiO2應用于淀粉涂膜液涂膜包裝圣女果,結果表明:在貯藏8 d后,與無膜組相比,N-TiO2與S-TiO2/淀粉復合涂膜處理對圣女果的腐爛率和失重率均有較好的抑制效果,N-TiO2與S-TiO2/淀粉復合涂膜液均可有效降低圣女果VC含量、總酸含量和總糖含量的損失,維持圣女果的采后新鮮度。其中,S-TiO2/淀粉復合膜對圣女果的腐爛率、失重率以及營養(yǎng)物質損失的抑制作用效果更佳。