γ氨基丁酸對黃秋葵采后品質及生理特性的影響

殷菲朧,喬 沛,李 靜,王秀麗,董新紅

(桂林理工大學化學與生物工程學院,廣西桂林 541004)

黃秋葵(Abelmoschusesculentus(L.)Moench),被稱為蔬菜之王,深受嶺南地區大眾所喜愛[1]。黃秋葵本身水分含量高、表面積大,極易失水、衰老、褐變及纖維化,嚴重影響其商品價值,因此,研究黃秋葵的貯藏保鮮具有一定的實際應用價值,目前主要集中在物理(氣調和冷藏)方面。辛松林等[2]研究表明,氣調可以有效的改善采后黃秋葵冷藏期間感官品質,延緩黃秋葵衰老。真空冷藏能明顯降低黃秋葵失重率及推遲呼吸高峰出現,延緩可溶性糖含量下降[3]。但氣調庫一次性投資較大,貯藏成本偏高;低溫貯藏則物流成本偏高,需要投入大量人力、物力和財力。而采用化學方法又由于化學物質殘留對人體具有毒副作用而受到限制。因此,尋找一種安全有效的生物保鮮技術就顯得尤為重要。

果實的采后衰老是貯藏過程中普遍存在的一種現象,不僅影響其外觀,同時還會造成其風味和營養的劣變。果實的采后衰老是由內在和外部環境因素所誘導和引起的一種主動過程,活性氧(ROS)的累積造成的膜脂過氧化損傷是生物體衰老的主要誘因[4]。正常機體內活性氧代謝處于平衡穩定,不僅不會對機體造成損害,還能起到一定的信息傳遞功能[5],但采后果蔬處于逆境脅迫條件下,富集的活性氧得不到有效清除,造成脂質、蛋白質及核酸的過氧化鏈式反應,加速果蔬的衰老褐變[6]。因此,果蔬采后品質降低與活性氧代謝引起的生理反應密切相關,而良好的保鮮技術和方法可以有效減少活性氧的積累,減輕過氧化對膜質的損傷,從而延緩果蔬的衰老和劣變。

γ-氨基丁酸(GABA)是一種四碳氨基酸[7],能有效減輕活性氧的積累,緩解逆境對有機體的傷害,并提高機體保護酶的活性[8]。外源GABA能夠促進桃[9-10]、甜瓜和香蕉[11]等果蔬內源GABA累積,增加抗氧化系統酶活性和保持能量水平,提高果實的抗逆性。目前GABA在采后黃秋葵常溫貯藏品質及生理特性的影響還未見報道。本研究采用GABA對采后黃秋葵進行處理,首先對黃秋葵失重率、葉綠素含量和VC含量進行分析,進而考察了GABA處理對黃秋葵抗氧化酶系活性、活性氧膜質過氧化產物的影響,旨在探討GABA處理維持黃秋葵的采后品質,延緩其衰老的可能機理,為GABA作為保鮮劑的應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

黃秋葵 桂林市某農貿市場,挑選新鮮、完整、無破損的黃秋葵備用;GABA(99%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;咪鮮胺(45%) 湖南新長山農業發展股份有限公司;所有實驗用化學試劑 均為國產分析純。

DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;SQP電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司;UV1800紫外分光光度 島津儀器(蘇州)有限公司;FA2004C分析天平 上海越平科學儀器有限公司;H2050R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;Revco Ex F24086V超低溫冰箱 美國Thermo公司;LHS-250HC-Ⅱ恒溫恒濕箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 黃秋葵經清水處理晾干后,先用0.1%的咪鮮胺水溶液浸泡3 min后,每組70個,分別在5、10、15 mmol/L的GABA水溶液中充分浸泡3 min,以清水處理為對照,涂層均勻后,自然晾干,分別于常溫條件(25 ℃)下貯藏。每3 d取樣(10個),當天測定失重后液氮冷凍打粉并低溫貯藏,用于測定其余指標。

1.2.2 失重率的測定 失重率參照帥良等[12]方法,每組3個,共4組,采用稱重法,按式(1)計算。

式(1)

式中:M1代表采樣0 d質量,g;M2代表每次取樣質量,g。

1.2.3 葉綠素含量測定 葉綠素含量測定參照李麗等[13]采用丙酮提取法,重復3次,分別測定提取液在663和645 nm處吸光值,根據Arnon公式,得總葉綠素含量,按式(2)計算。

式中:v代表采樣提取液總體積,mL;m代表取樣質量,g；20.29和8.05均為Arnon公式中由吸光系數分別得到的相關系數。

1.2.4 VC含量測定 VC含量測定參照李靜等[14]方法,采用2,6-二氯酚靛酚鈉滴定法測定抗壞血酸,含量用mg/100 g表示。

2,6-二氯酚靛酚鈉溶液標準滴定:以10 mL 0.1 mg/mL標準抗壞血酸溶液置于錐形瓶中,用2,6-二氯酚靛酚鈉溶液滴定至微紅色,15 s不褪色即為滴定終點,根據消耗的2,6-二氯酚靛酚鈉溶液的量,計算出1 mL染料溶液相當于抗壞血酸質量(ρ)。每次取樣均重復測3次。

樣品提取測定:取預冷50 mL離心管,稱取2 g秋葵粉,然后加入15 mL 20 g/L預冷的草酸溶液,旋渦振蕩30 s,冰浴靜止提取10 min,4 ℃下12000 r/min離心10 min,取10 mL上清液用2,6-二氯酚靛酚鈉溶液滴定至微紅色,15 s不褪色即為滴定終點,記下此時染料用量。同時以10 mL草酸溶液(20 g/L)作為空白,按照同樣方法進行滴定。以上操作重復3次。VC含量按式(3)計算。

式(3)

式中:V1代表樣品滴定消耗染料體積,mL;V0代表空白滴定滴定消耗染料體積,mL;ρ代表1 mL染料溶液相當于抗壞血酸的質量,mg/mL;VS代表滴定時所取樣品溶液體積,mL;V代表樣品提取液總體積,mL;m代表樣品質量,g。

1.2.5 丙二醛含量測定 丙二醛含量測定參照Zhang等[15]采取TBA顯色法測定并稍作修改。取預冷50 mL離心管,稱取2 g秋葵粉,然后加入10 mL預冷10% TCA溶液旋渦振蕩30 s,冰水浴靜置提取10 min,4 ℃下12000 r/min離心20 min,取上清液2 mL,加入2 mL的TBA溶液并在沸水浴加熱20 min,降至室溫,于5000 r/min離心15 min,取上清液,以0.6%的TBA溶液為空白,測量其在532、600和450 nm處的吸光度。以上操作重復3次。按式(4)計算:

MDA含量(μmol/g)={[6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450]×V}/(VS×m×1000)

式(4)

式中:V代表提取液總體積,mL;VS代表測定時所取樣品提取液體積,mL;m代表樣品質量,g。

1.2.6 過氧化物酶(POD)活性測定 取預冷50 mL離心管,稱取2 g秋葵粉,然后加入10 mL預冷0.1 mol/L pH5.5乙酸緩沖液(含1 mmol/L PEG、4% PVP和1% Trriton X-100)旋渦振蕩30 s,冰水浴靜置提取10 min,4 ℃下12000 r/min離心30 min,取上清液,低溫保存備用。過氧化氫酶活性參考Chu等[16]進行測定,以上操作重復3次。

1.2.7 過氧化氫酶活性及超氧化物歧化酶活性測定 取預冷50 mL離心管,稱取2 g秋葵粉,然后加入10 mL預冷0.1 mol/L pH7.8磷酸緩沖液(含5 mmol/L DTT和5% PVP)旋渦振蕩30 s,冰水浴靜止提取10 min,4 ℃下12000 r/min離心30 min,取上清液,過氧化氫酶活性參考Gao等[17]的方法進行測定;超氧化物歧化酶活性測定參考Chen等[18]的方法進行測定,以上操作重復3次。

1.3 數據處理

實驗結果采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(Duncan法,顯著水平P<0.05)和因子分析,采用OriginPro 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 GABA處理對黃秋葵失重率的影響

果實失重率是評價采后果蔬貯藏品質,反映采后果實內容物消耗速率的重要指標[12]。如圖1所示,隨著貯藏時間的延長,黃秋葵的失重率均呈逐漸上升趨勢,其中對照組21 d失重率最高為11.1%。5和10 mmol/L的GABA處理能明顯減緩采后黃秋葵的水分損失,尤其貯藏前期(3～12 d)的果實失重率與對照組有顯著差異(P<0.05),其中5 mmol/L的GABA處理組效果最好,在21 d時失重率僅為8.7%。與對照相比,15 mmol/L的GABA處理則促進了黃秋葵水分損失,表現為失重率提高。說明低濃度GABA處理對于減少黃秋葵貨架期的水分損失,對保持其新鮮品質具有較好效果。

圖1 GABA處理對黃秋葵失重率的影響Fig.1 Effect of GABA treatment on the weight loss rate of okra注:*表示10 mmol/L GABA與CK組存在顯著差異(P<0.05);**表示10 mmol/L GABA與CK組存在極顯著差異(P<0.01);無標識表示無顯著差異,全文同(通過最終分析10 mmol/L GABA效果最好,因此顯著差異只標注10 mmol/L GABA)。

2.2 GABA處理對黃秋葵葉綠素含量的影響

葉綠素廣泛存在于植物及果蔬中,其含量的降低會造成果蔬出現嚴重的黃化現象,影響其商品價值[19]。由圖2可知,在常溫貯藏期間,對照組和處理組葉綠素含量在貯藏過程中不斷下降,對照組葉綠素含量由0 d的0.1269 mg/g降為21 d的0.0745 mg/g,降低41.3%。10 mmol/L GABA處理效果最好,葉綠素含量3 d后一直極顯著高于對照組(P<0.01),從0 d的0.1269 mg/g降至21 d的0.1025 mg/g,降低19.2%,且21 d葉綠素含量為對照組的137.58%。說明10 mmol/L GABA處理能減緩葉綠素的降解,使黃秋葵果莢保持良好的外觀品質。5和15 mmol/L的GABA處理雖然也能抑制葉綠素含量降低,但與對照組差異不顯著。

圖2 GABA處理對黃秋葵葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of GABA treatment on chlorophyll content of okra

2.3 GABA處理對黃秋葵VC含量的影響

VC作為還原性物質,可消除和減輕活性氧等自由基對細胞的傷害[19],通過測定其含量可以反映采后黃秋葵生理狀況[20]。由圖3可知,所有處理組黃秋葵的VC含量均在貯藏過程中逐漸下降。對照組的VC含量下降幅度最大,由0 d的13.30 mg/100 g降至21 d的3.61 mg/100 g,下降72.9%;而10 mmol/L GABA處理組效果最佳,VC含量顯著高于對照組(P<0.05),VC含量由0 d的13.30 mg/100 g降至21 d的6.11 mg/100 g,下降54.1%。與對照相比,在貯藏末期(21 d),各種濃度的GABA處理均能明顯提高黃秋葵的VC含量,10 mmol/L GABA處理組VC含量為對照組的169.2%,具有極顯著差異(P<0.01)。說明GABA處理能有效減緩黃秋葵中VC的降解,維持較高水平的VC含量,保持黃秋葵果莢良好的營養品質。

圖3 GABA處理對黃秋葵VC含量的影響 Fig.3 Effect of GABA treatment on VC content of okra

2.4 GABA處理對黃秋葵丙二醛(MDA)含量的影響

MDA是脂質過氧化的主要產物之一,其含量的多少可作為采后秋黃葵貯藏期間衡量細胞膜透性和穩定性的重要指標之一[21]。由圖4可以看出,在常溫貯藏過程中,對照組黃秋葵中MDA含量呈逐漸升高趨勢(由0 d的5.1×10-3μmol/g上升至21 d的11.97×10-3μmol/g),不同處理組MDA含量均呈先增加后稍降的趨勢,且MDA含量均顯著低于對照組(P<0.05)。在低溫貯藏的鮮切石榴[22]和低O2高CO2處理后貯藏的白玉枇杷[23]的貯藏過程中,發現類似的MDA變化現象。因此,GABA處理能明顯延緩黃秋葵貯藏過程中細胞膜脂質過氧化進程,降低膜脂過氧化對細胞的損傷,減慢衰老褐變的速度,有助于延長黃秋葵采后的貨架期。

圖4 GABA處理對黃秋葵丙二醛(MDA)含量的影響Fig.4 Effect of GABA treatment on malondialdehyde(MDA)content of okra

2.5 GABA處理對黃秋葵過氧化物酶(POD)活性的影響

過氧化物酶(POD)可以催化過氧化氫的氧化反應,加速果蔬衰老褐變[24]。由圖5可知,15 mmol/L GABA處理組與對照組POD活性變化基本一致,呈先上升后降低的趨勢且貯藏前期(0～9 d)顯著(P<0.05)低于對照組,貯藏后期則與對照組差別不大。5 mmol/L的GABA處理組POD活性呈逐漸下降趨勢,一直低于對照組,且在0～9 d呈現顯著差異(P<0.05),12 d之后無顯著性差異(P>0.05);10 mmol/L GABA處理組POD活性逐漸下降且15 d之前顯著低于對照組(P<0.05),18 d無顯著差異。與對照相比,不同濃度的GABA處理會不同程度降低黃秋葵的POD活性,這與熱激處理的鮮切甜椒[25]和褪黑素處理的荔枝[15]中POD活性變化一致。結果表明不同濃度GABA處理(15 mmol/L處理后期除外)均可以明顯降低POD活性,尤以10 mmol/L GABA處理效果最佳。

圖5 GABA處理對黃秋葵過氧化物酶(POD)活性的影響Fig.5 Effect of GABA treatment on POD activity of okra

2.6 GABA處理對超氧化物歧化酶(SOD)活性

圖6 GABA處理對黃秋葵超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響Fig.6 Effect of GABA treatment on SOD activity of okra

表1 各生理指標間的相關性分析Table 1 Correlation analysis of all physiological indexes

2.7 GABA處理對過氧化氫酶(CAT)活性

CAT催化H2O2生成無毒性的水和分子氧從而降低活性氧自由基對組織細胞的損害,延緩果蔬的衰老,CAT活性可以反映采后果蔬對抗脅迫反應的能力[27]。由圖7可知,不同處理組CAT活性變化基本一致,呈逐漸下降的趨勢,其中5和10 mmol/L的GABA處理組高于對照組,尤其是10 mmol/L的GABA處理組效果具有極顯著差異(P<0.01),5 mmol/L的GABA處理后期(9 d之后)效果明顯(P<0.05),而15 mmol/L GABA處理組與對照組無顯著差異(P>0.05)。說明適宜濃度的GABA(5和10 mmol/L)處理可提高黃秋葵果莢中CAT活性,促進活性氧清除,降低膜脂過氧化,從而保持果莢的良好品質。

圖7 GABA處理對黃秋葵過氧化氫酶(CAT)活性的影響Fig.7 Effect of GABA treatment on CAT activity of okra

2.8 相關性分析

對黃秋葵保鮮的各生理指標進行相關性分析,結果如表1所示。黃秋葵貯藏時間和失重率、MDA含量呈極顯著正相關(P<0.01),與葉綠素含量、VC含量、CAT活性和POD活性呈極顯著負相關(P<0.01)。該結果進一步說明隨著貯藏的進行,果實的失水率也逐漸提高,葉綠素和VC逐漸降解,酶活性降低不足以及時清除植物體內產生的活性氧,隨著活性氧積累,膜脂過氧化損傷加劇,導致黃秋葵果莢的外觀和食用品質下降,直至最后衰老變質。

2.9 主成分分析

主成分分析旨在利用降維的思想使問題簡單化,同時得到更加科學有效的數據信息。目前關于采后果蔬貯藏品質方面應用較少,因此本文采用主成分分析法,以綜合評價指數來判定不同處理組在常溫貯藏過程中果蔬品質的變化。由表2可知,對黃秋葵保鮮過程中的指標進行標準化處理之后進行主成分分析,第1、2主成分特征值分別為4.663和1.189,第1、2主成分貢獻率分別為66.62%和16.984%,前2個主成分特征值均大于1且累積貢獻率達到83.604%,可見前2個主成分可以說明秋黃葵采后常溫貯藏期間有關數據的變化趨勢,完全符合主成分分析的基本要求,因此取前2個主成分進行數據分析。

表2 各指標特征值及方差貢獻率Table 2 Characteristic values and variance contribution rate of each indicator

由表3可知可用2個變量Y1、Y2代替原來的7個指標,得出線性組合為(其中Z1～Z7均為標準化變量):

同時以選取的第1、第2主成分的方差貢獻率α1(66.62%)、α2(16.984%)作為權數,構建綜合評價模型:F=α1Y1+α2Y2,即F=0.6629Y1+0.16984Y2。F值代表秋葵貯藏品質。

表3 各指標得分向量Table 3 Characteristic vector of each indicator

由圖8可知,貯藏期間,黃秋葵綜合評價指數均逐漸降低,這與實驗結果中隨著貯藏時間延長,黃秋葵貯藏品質逐漸下降相一致,其中GABA處理組相比對照組明顯延緩了黃秋葵衰老進程,即在一定程度上保持了秋葵的貯藏品質,綜合評定以10 mmol/L處理效果最好。

圖8 GABA處理對綜合評定指數的影響Fig.8 Effect of GABA treatment on the comprehensive assessment index

3 結論與討論

研究結果表明,GABA處理在一定程度上可抑制采后黃秋葵常溫儲藏期間水分的損失、POD活性、活性氧產生及丙二醛含量的積累,減緩葉綠素和VC的降解。同時也不同程度提高了秋葵常溫貯藏期間SOD活性和CAT活性,綜合評定以10 mmol/L GABA處理效果最好。相關性分析中,葉綠素含量與VC含量極顯著正相關(P<0.01),說明二者在黃秋葵采后貯藏過程中變化一致,隨著黃秋葵果實的發黃老化,VC含量逐漸降低;葉綠素和VC含量變化與MDA濃度和失重率極顯著負相關(P<0.01),說明MDA濃度可以直觀的作為秋葵貯藏過程中貯藏品質的評價指標。主成分分析表明,隨著貯藏時間的延長,黃秋葵品質相關的綜合評價指數均逐漸降低,不同濃度GABA明顯延緩了黃秋葵采后的品質下降,即在一定程度上保持了黃秋葵的貯藏品質。

對于不同的生理指標,三種濃度(5、10和15 mmol/L)影響效果并不完全一致。10 mmol/L對各生理指標的影響效果表現為有利于黃秋葵采后貯藏,而5和15 mmol/L總體表現不夠穩定,說明選擇合適的GABA濃度對果蔬進行保鮮處理也是一個很重要的考慮因素。另外,有研究表明,外源GABA處理可以刺激某些生長植株逆境脅迫條件下乙烯的產生[28-29]。那么究竟GABA處理是否刺激了刺激采后黃秋葵中乙烯的產生,黃秋葵各生理指標受不同濃度影響的變化是否與刺激乙烯合成的時間和劑量有關？這些問題還有待進一步研究。

丙二醛是ROS發生膜質過氧化的重要產物,是研究植物衰老生理和逆境脅迫生理的常用指標[20]。理論上來說,隨著采后果蔬的不可逆衰老進行,果蔬中MDA含量會逐漸增多直至果實衰老腐敗失去食用品質和商業價值。但在本研究中,對照組的MDA含量呈現不斷上升趨勢,而經GABA處理后,黃秋葵中MDA含量在貯藏前期(0～12 d)明顯逐步上升,后期則開始不斷下降(5 mmol/L處理組18 d后又升高)。這種現象其實在其他果實的采后貯藏過程中也有發現[22-23],可能與具體的貯藏條件和處理方式有關。

早期研究認為,可以清除植物體內的ROS防御酶系統主要有SOD、POD、CAT和抗壞血酸過氧化物酶(APX)等保護酶,保護酶活性的增加,可以及時清除系統產生的活性氧自由基,避免膜脂過氧化,保護膜系統完整性,從而延緩果實衰老[30]。但近年來研究發現,POD既可將活性氧H2O2分解為H2O清除掉,也可以催化H2O2氧化,將酚類物質和類黃酮物質氧化聚合形成褐色物質,引起果蔬的衰老褐變[14]。本研究中,GABA處理對黃秋葵的SOD和CAT活性均有不同程度的提高,但卻降低了其POD活性。Zhang等[15]研究也發現,褪黑素處理可以降低采后荔枝貯藏過程中的POD和PPO活性,從而有效延緩了荔枝的褐變進程。劉洪竹等[25]研究熱激處理對鮮切甜椒POD活性變化影響時,也有同樣發現[24]。也許POD在果蔬采后生理中的具體作用機理還需進行更多研究。

總之,合適濃度的GABA處理能有效延緩黃秋葵采后衰老,保持果莢較好的品質。GABA參與了有機體多個生物反應過程,在比較廣泛劑量范圍內對人體幾乎無毒性,所以GABA在延緩果蔬采后衰老,保持果蔬品質方面將有良好的應用前景。