野生亞側耳多糖的提取和對巨噬細胞Raw264.7的免疫調節作用研究

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(1.湖北文理學院食品科學技術學院·化學工程學院,湖北襄陽 441000;2.黑龍江八一農墾大學食品學院,黑龍江大慶 163000)

亞側耳(Hohenbueheliaserotina),又名冬蘑、元蘑、剝茸[1],屬于真菌門亞側耳屬,主要分布在黑龍江和吉林的山區林區等地。作為黑龍江山珍特產之一,元蘑味道鮮美,含有蛋白質、糖類、多酚及黃酮等多種營養物質[2],深受人們喜愛。研究發現,亞側耳多酚能明顯抑制HeLa細胞的體外增殖[3],而亞側耳分離得到的27 kDa核糖核酸酶(RNase)也被證明能夠抑制人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)逆轉錄酶和減少MBL2淋巴瘤細胞的生成[4]。目前元蘑現代化食品十分豐富,有元蘑膨化食品、元蘑營養粥和元蘑運動飲料等[5-7]。

多糖是多個單糖以糖苷鍵連接組成的聚合高分子碳水化合物[8],普遍具有免疫調節作用[9-11]。現代醫學研究發現,真菌多糖擁有抗癌、抗腫瘤等免疫作用[12-13]。熊川等[14]用水溶性靈芝子實體多糖刺激RAW264.7細胞后,發現試驗細胞的吞噬能力及細胞因子分泌量均得到提高。現有關于亞側耳多糖的報道普遍集中在亞側耳多糖的抗腫瘤、抗氧化、防輻射等方面[15-17],然而其對小鼠巨噬細胞RAW264.7的免疫活性研究不多見。本文以Raw264.7細胞為細胞模型,探討亞側耳水溶性多糖對巨噬細胞的體外免疫調節作用,為亞側耳多糖產品的合理開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞側耳 伊春市松源山特產品有限責任公司;苯酚 福晨化學試劑廠;氫氧化鈉 永大化學試劑有限公司;無水乙醇、硫酸、丙酮 西隴科學股份有限公司;葡萄糖標準品、福林酚乙液 索萊寶科技有限公司;RPMI-1640 培養基(含胎牛血清) 美國Gibco公司;水溶性四唑鹽(WST-1) 瑞士Roche公司;Raw264.7細胞 美國標準生物品收藏中心(ATCC)。

FA2004N型分析天平(精確值0.0001 g) 上海精密儀器儀表有限公司;R200-旋轉蒸發器 瑞士BUCHI公司;EL-800酶聯檢測儀 美國BioTek公司;722S分光光度計 上海精密儀器科學有限公司;SF-TDL-5A低俗離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司;數顯恒溫水浴鍋 諾基儀器有限公司;SY-2000A旋轉蒸發器 賢德實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 亞側耳多糖的提取及糖含量測定

1.2.1.1 亞側耳的預處理 將選購的野生亞側耳去雜,然后進行鼓風干燥(75 ℃)12 h,烘干至符合打磨標準后粉碎,過100目篩后置于干燥器中備用。

1.2.1.2 亞側耳多糖的提取和純化 根據前期研究[18-19],結合所選原料特性后制定提取純化方案。為了去除色素及小分子物質,先將50 g干燥的亞側耳子實體粉末與500 mL濃度為80%的乙醇溶液充分混合,室溫條件下攪拌3 h后,靜置過夜。將混合液在4000 r/min條件下離心10 min(以下提取純化操作過程中離心條件相同)后取沉淀,加入蒸餾水混勻(料液比為1∶10 g/mL)。置于水浴鍋中,在100 ℃條件下水浴3 h后再次離心,取上清液。然后將溶液在65 ℃條件下經減壓濃縮至原體積的1/5。向濃縮液中緩慢滴加4倍體積的無水乙醇并充分混合,冰箱中4 ℃靜置一夜。經離心棄上清后50 ℃下干燥12 h,得到亞側耳粗多糖。

將上述粗品用蒸餾水復溶(亞側耳粗多糖與水的質量比為1∶10),40%乙醇再次沉淀。50 ℃溫度下干燥12 h,得到亞側耳多糖(HSP)。

1.2.1.3 亞側耳多糖溶液中多糖含量的測定 參考改進的硫酸-苯酚法測定亞側耳多糖中的多糖含量[20]。繪制標準曲線。準確稱取無水葡萄糖標準品0.025 g于250 mL容量瓶中,加蒸餾水定容到刻度線。分別取標準液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL至干燥的試管中,每管補充蒸餾水至2.0 mL。分別向試管中添加0.5 mL 5%的苯酚溶液和5 mL的濃硫酸后冷卻至室溫,測定其在490 nm處的吸光度。

將0.01 g HSP粉末溶于100 mL蒸餾水中。吸取2.0 mL于試管中,加入1.0 mL 5%的苯酚溶液后,迅速加入5 mL濃硫酸,混勻后靜置至室溫。以蒸餾水反應物作對照,在490 nm處測定吸光度(每組設置3個平行,數值使用平均值)。

1.2.2 亞側耳多糖對巨噬細胞Raw264.7的免疫調節作用

1.2.2.1 亞側耳多糖對小鼠巨噬細胞的增殖作用 將巨噬細胞Raw264.7(100 μL,1×105cell/mL)和濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL的多糖溶液(100 μL)放置于96孔培養板中,空白對照加等量的生理鹽水。以RPMI-1640(含10%胎牛血清)為培養基的,在37 ℃、5%CO2、95%空氣條件下培養72 h,405 nm下測吸光度。增殖作用采用WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒測定,結果以免疫細胞增殖率表示，計算公式如下:

式(1)

式中:As:實驗組OD值;Ac:空白對照組OD值。

1.2.2.2 亞側耳多糖對巨噬細胞NO分泌量的影響 將細胞濃度為1×106cell/mL的巨噬細胞(對數生長期)到96孔培養板中,(5% CO2、95%空氣、37 ℃)培養24 h至細胞貼壁后,棄上清。目前在免疫細胞實驗中普遍以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作為陽性對照[21-22]。以PBS(磷酸緩沖鹽溶液)作為空白對照組、1 μg/mL LPS作為陽性對照組、HSP組的濃度分別為0、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL(每孔100 μL)。繼續培養24 h后取細胞培養上清液(100 μL),與等體積的Griess試劑混合,避光反應10 min,再用酶標儀在540 nm處測吸收值。NO濃度參考NaNO2(1～200 μmol/L)標準曲線計算，標準曲線公式為：y=0.0107x+0.0673,R2=0.9997。

1.2.2.3 亞側耳多糖對巨噬細胞的細胞因子釋放的影響 對RAW264.7巨噬細胞(對數生長期)進行傳代處理,配成細胞濃度為1×106cell/mL的細胞懸液置于24孔培養孔中。以1 μg/mL的LPS作為陽性對照,生理鹽水作為空白對照,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試驗組中添加的多糖濃度梯度為0、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primers name and sequence

為了得到良好的線性關系,白細胞介素(interleukin,IL)-1β因子和前列腺素E2(prostaglandins E2,PGE2)的試驗組選擇25 μg/mL濃度以下的濃度進行試驗,各梯度濃度分別為0、3.125、6.250、12.500、25.000 μg/mL。每個多糖處理組均設3個復孔,以上添加計量均為100 mL。在37 ℃、5% CO2、95%空氣條件下培養48 h。用ELISA試劑盒檢測細胞上清液中的細胞因子的表達量。

1.2.2.4 多糖對巨噬細胞免疫因子基因表達的影響(反轉錄-聚合酶鏈式反應) HSP(0、12.50、25.00、50.00 μg/mL)或LPS(1 μg/mL)存在下的巨噬細胞Raw264.7(1×106cell/mL),在24孔細胞培養板上37 ℃、5%CO2、95%空氣條件下培養18 h。收集細胞,用Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取總RNA,-80 ℃保存備用。以提取的RNA(2 μg)為模板,用oligo-(dT)20primer和Superscript III RT(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)制備cDNA,采用Go Taq Flexi DNA 聚合酶(Promega Madison)和PCR引物(表1)用PCR技術進行擴增。PCR擴增條件:預變性(94 ℃,3 min),進行重復變性(94 ℃,30 s),退火(56 ℃,40 s)和延伸(72 ℃,1 min)30次,保溫(72 ℃,10 min)。染色后的PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳,用凝膠圖像分析軟件進行掃描和分析(Kodak Digital Science,Kennesaw,GA,USA)。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 亞側耳多糖中的糖含量

以葡萄糖濃度(x)為橫坐標,吸光度(y)為縱坐標,繪制標準曲線如圖1。經公式計算得到HSP溶液的糖含量為(85.176±1.47) μg/mL,HSP粉末糖含量為85.18%。由于試驗制備得到的HSP并不是由單一的葡萄糖組成,而是一種多糖復合物,因此需對亞側耳多糖進行成分分析后,再進一步測定糖含量。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

2.2 亞側耳多糖對巨噬細胞的增殖作用

巨噬細胞作為參與免疫系統調節的免疫效應細胞,其功能正常與否直接或間接關系到免疫應答過程中的抗原呈遞和抗原清除能力[23]。LPS能夠刺激小鼠巨噬細胞Raw264.7釋放細胞因子,因此通常以此作為測定某種成分對免疫系統是否具有調節活性的陽性對照。不同濃度的HSP對巨噬細胞增殖活性的影響如圖2a所示。在添加濃度為12.5 μg/mL HSP培育24 h后,Raw264.7細胞的增殖率明顯升高。并且在12.5～100 μg/mL范圍內,巨噬細胞Raw264.7的增殖率隨HSP劑量的增加而增加(P<0.05),呈劑量依賴關系,且對Raw264.7無細胞毒害作用。添加HSP(1～100 μg/mL)的培養基顏色清澈,細胞透亮,長勢良好,見圖2b、圖2c。

圖2 HSP對巨噬細胞Raw264.7增殖率的影響Fig.2 Effect of HSP on cell proliferation of Raw264.7 cells注:a:不同字母表明組間的顯著性差異(P<0.05),圖3～圖7同;b:試驗前細胞形態圖;c:100.00 μg/mL HSP培育24 h后細胞形態圖。

2.3 亞側耳多糖對巨噬細胞NO分泌量的影響

NO分泌水平是巨噬細胞激活的一個重要指標[24]。巨噬細胞受刺激產生的NO能夠協同機體對抗外來抗原,影響抗腫瘤、抗病毒和抑制胞內病原體增殖等免疫活性[25]。試驗細胞中NO釋放量的變化如圖3,NO的分泌量與HSP劑量呈現正相關,有劑量依賴關系。HSP低劑量組(12.5 μg/mL)與空白組(無HSP添加)相比,NO生成量顯著提高(P<0.05)。HSP在濃度為100 μg/mL時,Raw264.7巨噬細胞分泌NO的量為29.94 μmol/L,與LPS陽性對照組在Raw264.7中生成NO(30.43 μmol/L)的量相接近,兩組之間沒有顯著差異(P>0.05)。試驗中HSP顯著增加了巨噬細胞釋放NO的能力,可以認定為HSP是巨噬細胞免疫調節物質,具有免疫調節活性。

圖3 HSP對巨噬細胞Raw264.7中NO的影響Fig.3 Effect of HSP on NO production in macrophage Raw264.7 cells

2.4 亞側耳多糖對巨噬細胞的細胞因子釋放的影響

真菌多糖可以通過活化效應巨噬細胞而釋放細胞因子,從而調控機體免疫系統及免疫通路[26]。其中,TNF-α是自身免疫性疾病中重要的炎癥介質,能夠激活T細胞,并誘導中性粒細胞聚集,刺激吞噬行為的產生[27-28]。如圖4所示,與亞側耳多糖濃度為0的空白組相比較,不同含量的多糖組分均能夠刺激巨噬細胞釋放細胞因子TNF-α的活性。TNF-α的分泌量同HSP濃度呈正相關,但是隨HSP濃度的增加,分泌量遞增速度減慢。HSP以100 μg/mL的濃度處理Raw264.7細胞后,TNF-α含量為14.344 ng/mL,與LPS組相接近,說明HSP對TNF-α的分泌有促進作用。

圖4 HSP對巨噬細胞中TNF-α釋放的影響Fig.4 Effect of HSP on TNF-α release in macrophages

IL-1β是一種能夠活化巨噬細胞,并參與抗體產生的免疫因子。圖5為HSP作用下的巨噬細胞IL-1β表達量的變化,添加HSP或LPS后較空白組的IL-1β分泌量都極顯著升高(P<0.05)。在韓真[29]的實驗中,使用200 μg/mL的蜜環菌葡聚糖溶液刺激RAW264.7巨噬細胞后,IL-1β含量達到空白組的1.5倍。而在本試驗中,低劑量添加組(3.125 μg/mL)的IL-1β分泌量與空白組相比較,達到其4倍之多。在25.000 μg/mL HSP作用濃度下刺激RAW264.7免疫細胞產生的IL-1β分泌量(31.9524 pg/mL,)與1 μg/mL LPS陽性對照組分泌量(31.8793 pg/mL),無顯著性差異(P>0.05),表明HSP對IL-1β的釋放具有正向促進作用。

圖5 HSP對巨噬細胞中IL-1β釋放的影響Fig.5 Effect of HSP on IL-1β release in macrophages

PGE2是廣泛存在于有機體內的一種前列腺素類物質。在維持體內環境及炎癥調節方面,PGE2能夠有效與不同受體結合并發揮相關作用[30]。HSP對PGE-2的影響結果如圖6所示,在3.125～25.000 μg/mL濃度范圍內,HSP能夠促進PGE-2細胞因子的分泌,并且存在濃度依賴性關系。在前期研究[24]中,使用真姬菇多糖提取物刺激巨噬細胞后,PGE2分泌量受添加真姬菇多糖提取物濃度影響,這與本試驗結果相似。但真姬菇多糖溶液的添加濃度在100 μg/mL時PGE2分泌量才與陽性對照組相接近,而25 μg/mL HSP刺激產生的PGE2量(1.8174 ng/mL)接近LPS陽性對照組(1.9227 ng/mL),證明HSP對PGE2有較強的刺激作用。

圖6 HSP對巨噬細胞中PGE2釋放的影響Fig.6 Effect of HSP on PGE2 release in macrophages

巨噬細胞的吞噬能力可直接或間接的體現其免疫應答能力。試驗中PEG2、IL-1β和TNF-α三種細胞因子分泌量的變化表明,HSP能夠通過促進免疫因子的產生,從而提高Raw264.7細胞的免疫防御能力。

圖7 各免疫因子mRNA的RT-qPCR水平Fig.7 RT-qPCR levels of mRNA of immune factors

2.5 多糖對巨噬細胞免疫因子轉錄水平表達的影響

4 結論

研究發現亞側耳水溶性多糖在體外細胞實驗中表現出較強的免疫活性和低細胞毒性。HSP能夠促進Raw264.7巨噬細胞中NO、PGE2、COX-2、IL-6、iNOS、TNF-α和IL-1β等細胞因子的釋放。此外HSP也能夠有效提高iNOS、COX-2、IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA表達量。因此HSP可以作為天然免疫調節劑應用到食品及藥品領域中,具有廣闊的研究和應用前景。今后,我們將會對HSP多糖的免疫活性機理及其構效關系進行進一步的深入研究。