直穗小檗果粉對STZ誘導的Ⅰ型糖尿病大鼠糖脂代謝的調節作用

1,

(1.青海大學省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室,青海西寧 810016;2.青海大學農牧學院,青海西寧 810016;3.中國科學院西北高原生物研究所,青海西寧 810001;4.中國科學院大學,北京 100049)

直穗小檗(BerberisdasystachyaMaxim.)、沙棘(HippophaerhamnoidesL.)和唐古特白刺(NitrariatangutorumBobr.)的果實泛稱“三刺”果。在西北地區,蒙、藏、維吾爾等少數民族將其作為藥用與食用的傳統野生漿果,因其為低矮灌木,且具刺,因此統稱為“青海三刺”。直穗小檗果實作為高原特色漿果植物資源,天然無毒,具有多種活性物質[1-2],20世紀80年代,已有添加小檗果汁的青海三刺飲料問世[1]。而直穗小檗果在降血脂、降血糖方面的作用和應用還未見報道。

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一種由多種病因引起的以慢性高血糖為主要特征的代謝紊亂綜合癥。研究證明,Ⅰ型糖尿病是完全的胰島素依賴性疾病,是由胰島素分泌胰島β細胞的免疫相關破壞造成的疾病,通常導致高血糖癥,高脂血癥,和其他糖尿病并發癥[3]。近年來,糖尿病調節治療方面取得了很大的進展,目前糖尿病藥物主要包括胰島素療法、口服降糖治療和氧化應激相關的補充劑治療[4]。同時,還有西藥及合成藥,如α-糖苷酶抑制劑類、磺脲類和雙胍類等化學藥物直接作用于胰島細胞或者改善胰島素敏感性間接作用[5]。化學藥物降糖效果顯著、針對性強、降糖機制比較明確,但在降糖的同時也帶來許多副作用,特別是對糖尿病并發癥的治療收效甚微。針對這一現象,采用天然藥物制備具低副作用的降血脂、降血糖的藥物尤為迫切,因此,開發具有良好降脂降糖作用的天然藥物產品將具有良好的應用前景[6]。

本論文采用鏈脲酶素(STZ)誘導的Ⅰ型糖尿病大鼠,對直穗小檗果粉調節糖尿病大鼠血糖和血脂功能進行研究,并初步探討其調節的作用機制,以期為研發干預糖尿病的功能性食品及青海地區直穗小檗的綜合開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

四周齡雄性SD大鼠(8～9周,160～180 g) 甘肅大學,中國醫學實驗動物中心購買(動物合格證號:SYXK(甘)2011-0001),于實驗室內將大鼠單獨飼養在鼠籠中,按照光照12 h及黑暗12 h的飼養周期,在溫度(22±1) ℃,濕度42%±2%條件下飼養1周后進行實驗,大鼠在實驗過程中,以標準嚙齒動物供給所需食物和蒸餾水,所有的動物方案在“National Institute of Health Guide”指導下進行;直穗小檗鮮果 產自青海互助;鏈脲酶素(Streptozotocin,STZ) 北京中生瑞泰科技有限公司;格列本脲片 同仁堂大藥房;甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL)、超氧陰離子試劑盒、羥自由基試劑盒、谷氨酸轉氨酶(AST)、谷丙氨酸轉氨酶(ALT)、脂蛋白酯酶(LPL)、肝酯酶(HL)試劑盒、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH-Px)試劑盒 南京建成生物科技有限公司。

DZX6020真空干燥箱 上海南榮儀器公司;UV-722N可見紫外分光光度計 上海尼柯有限公司;HD型恒溫水浴鍋 遼陽市恒溫儀器廠;血糖測試儀及血糖試紙三諾 天士力大藥房;Bio-Rad680型酶標儀 美國伯樂公司;DS-1型組織勻漿儀 上海正慧工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 直穗小檗果粉的制備 直穗小檗鮮果于55 ℃,真空干燥6 h。然后直穗小檗果實去籽,用超微粉碎機粉碎(2000 r/min,1～2 s)后過80目篩網,即得直穗小檗果粉(BDF)。

1.2.2 Ⅰ型糖尿病大鼠模型的建立 大鼠禁食12 h后采用低劑量的鏈脲酶素(STZ)誘導[7]。將STZ溶解于新鮮的檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mol/L的檸檬酸鈉和0.1 mol/L檸檬酸,pH4.2～4.5),后立即以60 mg/kg的單次劑量對大鼠進行腹膜內注射進行造模。正常對照大鼠用等體積的檸檬酸鈉緩沖液注射。在造模期間,給予大鼠5%葡萄糖溶液過夜以克服藥物誘導而造成的低血糖期。于STZ或檸檬酸緩沖液注射試驗72 h后測定血糖:從大鼠的尾尖端收集血液,用血糖試紙檢測血液中的葡萄糖,血糖值大于16.80 mmol/L的大鼠被選定為Ⅰ型糖尿病模型大鼠。

藥物治療模型大鼠四周,末次給予受試物后,使用腹腔注射水合氯醛溶液對大鼠進行麻醉,麻醉后采用頸總動脈插管收集血液。采血后的血樣在室溫下靜止2 h后,經離心(3000 r/min,10 min),得到血清,并在-80 ℃冷凍直至分析。取血完畢后,將大鼠的肝臟、腎臟以及脾臟剝離出后,用磷酸鹽緩沖鹽水漂洗(PBS,pH=7.4)后,濾紙吸去多余液體并-80 ℃冷凍直至分析。同時,在每塊器官的同一部位切去一小塊組織,投入10%福爾馬林溶液中固定。

1.2.3 實驗分組及灌胃情況 空白組和模型組每天灌胃給予超純水;陽性藥組每天灌胃給予格列本脲1次(0.02 g/kg);受試藥物組每天灌胃給予直穗小檗果粉1次(低劑量組0.4 g/kg,高劑量組1.6 g/kg),五組均連續灌胃給藥28 d(詳細給藥濃度見表1):

表1 大鼠的分組情況及各組給藥量Table 1 The group situation and given amount of medical for each group

1.2.4 各實驗組大鼠健康狀況及體重的統計 在試驗期間,每周[即-7(造模前7 d)、0、7、14、21、28 d]觀察大鼠的健康狀況,包括飲水量、飲食量、毛色以及脫毛與否、排尿量(墊料干燥程度)、精神狀態等方面的觀察。

在試驗期間,每周(即-7、0、7、14、21、28 d),稱各組大鼠的體重。

1.2.5 血糖相關指標的測定 末次給藥灌胃結束后禁食過夜,從大鼠的尾靜脈獲得用于葡萄糖測定血樣。血糖的測定采用血糖儀和血糖試紙進行測量。血清胰島素水平通過使用胰島素ELISA試劑盒進行測定。

肝臟、肌肉勻漿在冰冷的培養基中通過組織均質化制備(pH為7.4,10 mmol/L的Tris-HCl,0.1 mmol/L的EDTA-2Na,10 mmol/L蔗糖,0.8% NaCl),并在4 ℃下3000 r/min離心10 min后收集上清液。基于Keppler的方法[8]使用糖原測定試劑盒測定肝臟、肌肉中的糖原含量。

1.2.6 血脂相關指標及脂代謝酶活性的測定 血清血脂包括甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)采用試劑盒測定。極低密度脂蛋白(VLDL)是根據Wilson等[9]的方法計算(式1)。

VLDL=0.2×TG

式(1)

肝臟勻漿在冰冷的培養基中通過組織均質化制備,并在4 ℃下3000 r/min離心10 min后收集上清液,上清液制備好后用于測定肝臟標志酶和脂質代謝酶。肝臟標志酶谷氨酸轉氨酶(AST)和谷丙氨酸轉氨酶(ALT),兩種脂質代謝酶即脂蛋白酯酶(LPL)和肝酯酶(HL)含量分別采用試劑盒測定。

1.2.7 體內抗氧化活性的測定 胰腺勻漿在冰冷的培養基中通過組織均質化制備,并在4 ℃下3000 r/min離心10 min后收集上清液。制備所得胰腺上清液和血清用于體內抗氧化活性酶活性測定。蛋白質濃度根據Bradford[10]的方法測定,并以牛血清白蛋白(BAS)為標準。脂質過氧化采用Armstrong等[11]報道方法,采用Zhang等[12]所述的方法測量過氧化氫酶(CAT)的活性。超氧化物歧化酶(SOD)活性通過Marklund所報道的方法[13]。還原型谷胱甘肽酶(GSH-Px)的活性參照Lawrence等[14]的方法。

1.2.8 病理組織切片 取出已固定的胰腺組織,切取合適厚度的組織。經過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片與烤片、脫蠟及水化、染色、脫水、透明和封片的操作過程制得石蠟切片,晾干后即可觀察切片。

1.3 實驗數據分析

2 結果與分析

2.1 各動物分組試驗期間的健康狀況

實驗期間,各試驗組大鼠的健康狀況記錄見表2。空白組大鼠攝食和飲水均屬正常水平,毛色光亮,糞便顏色和量正常,墊料干燥,精神狀態活潑健康。模型組大鼠體毛色發黃,暗淡,且脫毛現象嚴重,多尿,飲水量和飲食量較大,墊料潮濕帶有酸澀味,精神萎靡,體質虛弱,易怒較為暴躁,實驗期間有個別老鼠死亡。陽性藥組大鼠較正常大鼠毛色發黃,較模型組少脫毛,多尿,飲水量和飲食量大,墊料較模型組干燥,精神不活潑。直穗小檗果粉樣品組:兩劑量組大鼠毛色部分發黃,脫毛輕,多尿,飲水量和飲食量大較模型組明顯減輕,精神活潑,有追逐現象發生。

2.2 各動物分組試驗期間體重變化

表2 各動物分組試驗期間的健康狀況Table 2 The health condition of each group

表3 直穗小檗果粉對Ⅰ型糖尿病大鼠體重的影響Table 3 Effect of fruit of Berberis dasystachya M.on the body weight of TypeⅠdiabetic

表4 直穗小檗果粉對Ⅰ型糖尿病大鼠血糖的影響Table 4 Effect of fruit of Berberis dasystachya M.on the blood glucose of TypeⅠdiabetic

實驗期間,各試驗組大鼠在給藥-7、0、7、14、21、28 d的體重記錄見表3。由表3可知,模型組體重在實驗期間明顯下降,這與Ⅰ型糖尿病的發病患者表現出的典型癥狀一致(即體重迅速下降)。與模型組相比,從第7 d開始直穗小檗劑量組體重均極顯著(P<0.01)上升。給藥最后一天(28 d),相比模型組糖尿病大鼠的體重,不同劑量(0.4、1.6 g/kg)的果粉給藥大鼠體重分別可增幅16.29%和27.02%。此外直穗小檗果粉對糖尿病大鼠體重急劇下降的改善隨劑量的增加而增強,其中,陽性組大鼠的體重與模型組相比有極顯著性差異(P<0.01),直穗小檗劑量組大鼠的體重與模型組相比有極顯著性差異(P<0.01)。以上體重結果說明直穗小檗果粉能顯著緩解Ⅰ型糖尿病所致的體重下降。

2.3 直穗小檗果粉對Ⅰ型糖尿病血糖的影響

實驗期間,各試驗組大鼠在給藥-7、0、7、14、21、28 d的血糖記錄見表4。如表4所示,健康正常大鼠的血糖水平在5.00 mmol/L左右保持穩定,由于低濃度鏈脲酶素STZ直接損傷胰島細胞,導致了Ⅰ型糖尿病,因此造模后,各組造模大鼠的空腹血糖(FBG)與正常大鼠相比均極顯著升高(P<0.01)。在給藥最后一天(第28 d),低劑量和高劑量果粉組血糖相比模型組分別降低25.17%和26.93%,各給藥組大鼠的血糖與模型組相比均極顯著下降(P<0.01),且直穗小檗果粉的降血糖作用隨劑量的增加而增強。采用直穗小檗果粉對模型組大鼠進行治療后,血糖水平的顯著增加在治療階段具有劑量依賴性和時間依賴性。因此,直穗小檗果粉可顯著緩解由STZ誘導的高血糖癥狀,其高劑量組的治療效果與陽性藥格列本脲片相當。

2.4 直穗小檗果粉對Ⅰ型糖尿病胰島素水平的影響

圖1展示了各試驗組大鼠在給藥28 d后血清中胰島素的水平。STZ誘導的糖尿病大鼠相比健康正常大鼠,血清胰島素水平極顯著降低(P<0.01)。如圖1所示,相比模型組,不同劑量的直穗小檗果粉和格列本脲給藥組,均可極顯著增加糖尿病大鼠血清胰島素水平(P<0.01)。此外,與模型組相比,果粉高劑量組可顯著增加糖尿病大鼠血清胰島素水平1.047倍。胰島素檢測結果表明,直穗小檗果粉能顯著緩解Ⅰ型糖尿病所致的胰島素分泌功能障礙的情況,但其緩解的原因有待進一步明確。

圖1 直穗小檗果粉對Ⅰ型糖尿病大鼠胰島素水平的影響Fig.1 Effect of fruit of Berberis dasystachya M.on the iInsulin level in Type Ⅰ diabetic rats注:NC:空白組;MC:模型組;PC:陽性藥組;BDF-L:直穗小檗果粉低劑量組;BDF-H:直穗小檗果粉高劑量組;# P<0.05,##P<0.01與正常組比較;*P<0.05,**P<0.01與模型組比較。圖2～圖4同。

2.5 直穗小檗果粉對Ⅰ型糖尿病大鼠肝糖原和肌糖原的影響

本實驗進一步研究了直穗小檗果粉在抗高血糖過程中,是否參與肝糖原和肌糖原合成,試驗結果如圖2所示。在STZ誘導的Ⅰ型糖尿病大鼠中(模型組),相比空白組大鼠其肝糖原和肌糖原水平均極顯著減少(P<0.01)。直穗小檗果粉高劑量組與模型組相比,可極顯著的提高肝糖原含量1.03倍;格列苯脲組與模型組相比,可極顯著地提高肌糖原含量0.35倍。直穗小檗果粉和格列苯脲的治療后結果表明,二者均可改善糖的代謝控制,因此促進了更高效的能量代謝。然而,直穗小檗果粉參與糖原合成以維持穩定的血糖水平的細胞機制,需要進一步的實驗得出明確的結論。

表5 直穗小檗果粉對STZ誘導的大鼠的血脂指標的影響Table 5 Effect of fruit of Berberis dasystachya M.on theserumlipid in Type Ⅰ diabetic

圖2 直穗小檗果粉對Ⅰ型糖尿病大鼠肝糖原(A)和肌糖原(B)水平的影響Fig.2 Effect of fruit of Berberis dasystachya M.on the level of hepatic and muscle glycogen of Type Ⅰ diabetic rats

2.6 直穗小檗果粉對Ⅰ型糖尿病血脂及脂代謝的影響

STZ誘導的糖尿病,會使得大鼠胰島細胞發生核固縮和玻璃樣病變。其脂代謝隨之發生紊亂。同時大鼠的脂代謝發生紊亂,相關血脂指標及脂代謝相關的酶活性亦發生紊亂。脂蛋白代謝異常可引起各種低血糖癥或高血脂癥。由于脂質水平升高,導致糖尿病與冠狀動脈、心臟疾病、過早動脈粥樣硬化的風險增加[15]。血清TC、TG含量是高血脂癥的重要指標,HDL能轉運膽固醇,其中載脂蛋白又能激活卵磷脂-膽固醇轉脂酰基酶,催化卵磷脂分子中β位脂肪酰基與膽固醇作用生成膽固醇酯,使TC和TG含量降低,所以HDL是高血脂癥的輔助標志。同時,研究發現,相比于正常對照大鼠或小鼠,STZ誘導的Ⅰ型糖尿病大鼠或小鼠TG,TC和LDL水平顯著增加,HDL水平顯著下降[15-17]。表5結果顯示空白健康大鼠、模型組大鼠和給藥組大鼠的四種血脂水平。

與模型組相比,當用不同濃度的直穗小檗果粉的給藥處理糖尿病大鼠后,糖尿病大鼠的四項血脂水平均呈現明顯的改善。其中,果粉高劑量組相比模型組大鼠四項指標TC、TG、LDL和VLDL分別降低41.17%、33.52%、57.30%、32.85%,HDL調節上升1.44倍。同時,實驗表明,直穗小檗果粉治療STZ誘導的Ⅰ型糖尿病大鼠后,高劑量組對其不同的血脂指標的調節效果與格列本脲的效果相當,而格列本脲作為化學合成的藥品,其對機體有一定的副作用,因此可采用天然植物即直穗小檗果粉可做替代保健品使用。

本研究中,直穗小檗果粉治療STZ誘導的Ⅰ型糖尿病大鼠28 d后,發現在脂質代謝的相關指標發生改變,即TC、TG、LDL相比STZ誘導的糖尿病大鼠顯著衰減,并可增加糖尿病大鼠血清HDL的濃度。因此,直穗小檗果粉能夠減少動脈粥樣硬化和其他心血管糖尿病并發癥的風險[18-20]。推測直穗小檗果粉降低血脂水平的作用機制可能有三種,其一,可能充當載體參與膽固醇的代謝和加速傳輸和/或血清脂質的排泄[21];其二,可能作為膽汁酸合成的促進劑[22];其三,可能作為自由基清除劑,以防止LDL形成氧化的LDL[18]。然而,直穗小檗果粉影響脂質代謝的機制在尚未明確,需要進一步研究。

2.7 直穗小檗果粉對Ⅰ型糖尿病脂代謝的影響

HL是由肝實質細胞合成的一種具有磷A1和甘油三酯水解酶活性,對血漿脂質轉運有重要作用的胞外蛋白,HL活力異常與動脈粥樣硬化、糖尿病有較高的相關性。LPL是脂肪細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、乳腺細胞以及巨噬細胞等實質細胞合成和分泌的一種糖蛋白[17-18]。LPL是脂蛋白代謝的關鍵酶,是水解富含甘油三酯蛋白中TG的關鍵酶[17]。LPL和HL可以分解TG并分解為甘油和游離脂肪酸(FFA),采用銅試劑測定其分解產生的游離脂肪酸就可以分別計算出HL和LPL的活性[19]。因此,LPL和HL酶活性的升高,意味著其脂代謝的增加以及脂蛋白含量的降低。AST和ALT是肝損傷或壞死重要標志[19]。肝臟內的AST與ALT含量在一些藥物的刺激下,其體內肝組織受到脂肪細胞侵潤,影響相關肝細胞酶活性。一般情況下,格列本脲、辛伐他汀及其他化學藥物都會對肝組織有一定的影響。表6為空白大鼠、模型組大鼠及給藥組大鼠四種肝臟標志酶的水平。

表6 直穗小檗果粉對STZ誘導的大鼠肝臟標志酶的影響Table 6 Effect of fruit of Berberis dasystachya M.on liver markers in Type Ⅰ diabetic

由表6可知,與模型組大鼠相比,直穗小檗果粉能夠使患病大鼠的HL和LPL酶活性增加,LPL是清除富含TG脂蛋白的限速酶,從而發揮了其在脂蛋白循環中的重要作用。同時可使糖尿病大鼠的HL活性增加,通過HL作為配體,促進肝細胞攝取膽固醇和乳糜微粒殘粒,降低血漿中總膽固醇和甘油三酯濃度,進而達到調節機體脂代謝紊亂的作用。本研究表明,直穗小檗果粉治療STZ誘導的糖尿病大鼠一段時間后,可顯著增強以上兩種關鍵酶的活性,從而調節脂質代謝。

相比格列本脲陽性藥組,直穗小檗果粉給藥組的AST和ALT活性均有不同程度的降低,說明陽性藥組即格列苯脲對肝臟具有損傷作用,而直穗小檗果粉對肝臟則損傷作用較小,直穗小檗果粉高劑量組相比陽性藥組,其AST和ALT活性呈現極顯著的下降(P<0.01),表明直穗小檗果粉可減少肝損傷。直穗小檗果粉治療的糖尿病大鼠體內兩個肝臟標記酶活性的降低,可能是由于直穗小檗果粉表現出有效的抗氧化劑活性,衰減了肝臟內的細胞損傷。

2.8 直穗小檗果粉對Ⅰ型糖尿病大鼠氧化應激的影響

糖尿病導致升高的血糖和血脂濃度,與肝,腎和胰腺等組織中活性氧化物的形成相關聯[20]。Davi等也已經證明胰島素抵抗的發生與系統性氧化應激有關[18,21]。同時,有研究表明使用抗氧化劑治療糖尿病實驗動物,可降低糖尿病的相關癥狀,推測可能減少了患病動物體內氧自由基和脂質過氧化物的水平[22]。動物組織或血清內MDA含量作為脂質過氧化程度的標志物,MDA含量的升高意味著組織內或者體內過氧化物損傷增加。CAT、SOD和GSH-Px是動物體內重要的氧化應激防御酶,其活性的增加表明可減少體內或組織內的氧化損傷[23]。圖3為各試驗組大鼠血清和胰腺中MDA含量的變化,圖4為各試驗組大鼠血清和胰腺中CAT、SOD和GSH-Px酶活水平的變化。

圖3 直穗小檗果粉對Ⅰ型糖尿病大鼠血清(A)和胰腺(B)中丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of fruit of Berberis dasystachya M.on MDA in serum(A)and pancreas tissue(B)of Type Ⅰ diabetic rats

圖4 直穗小檗果粉對Ⅰ型糖尿病大鼠血清(A,B,C)和胰腺(D,E,F)中CAT,SOD,GSH-Px含量的影響Fig.4 Effects of fruit of Berberis dasystachya M.on CAT,SOD and GSH-Px in serum(A,B,C)and pancreas tissue(D,E,F)of diabetic rats

直穗小檗果粉對STZ誘導的糖尿病大鼠血清和組織中的MDA、CAT、SOD和GSH-Px的含量及活性均有影響,結果如圖3和4所示,與模型組相比,直穗小檗果粉的不同劑量(0.4、1.6 g/kg)均可使MDA水平顯著降低,并且可升高糖尿病大鼠血清和組織內CAT、SOD和GSH-Px的活性(P<0.05或P<0.01)。模型組的糖尿病大鼠血清和組織內的MDA含量相對于正常對照大鼠分別升高了1.06倍和2.00倍。當患糖尿病大鼠灌胃給予低劑量和高劑量直穗小檗果粉治療28 d后,胰腺組織中MDA水平分別減少64.04%和45.00%;血清中MDA水平分別減少56.65%和29.87%。

相比于空白組健康大鼠,模型組大鼠胰腺組織中的CAT、SOD和GSH-Px水平分別下降55.59%,58.04%和56.27%;模型組大鼠的血清中的CAT、SOD和GSH-Px的水平分別降低63.53%,60.23%和61.96%。同時,相比模型組大鼠,發現在糖尿病大鼠血清中的CAT、SOD和GSH-Px酶活性,通過低劑量組直穗小檗果粉治療后分別增幅88.16%、17.52%和63.43%;通過高劑量組直穗小檗果粉治療后分別增加了1.46、1.36和1.45倍。相比模型組大鼠胰腺組織中的CAT、SOD和GSH-Px酶活性,通過低劑量組直穗小檗果粉治療可顯著提高三種氧化酶活性,可分別增加45.97%、45.02%和36.80%;通過高劑量組直穗小檗果粉治療后分別增加了1.22、1.21倍和1.30倍。

不同劑量直穗小檗果粉治療STZ誘導的Ⅰ型糖尿病大鼠28 d后,均可使糖尿病大鼠血清和組織的MDA水平顯著降低,并且可以升高糖尿病大鼠血清和胰腺組織內CAT、SOD和GSH-Px的活性。以上結果表明,直穗小檗果粉可以減輕STZ誘導的Ⅰ型糖尿病大鼠胰腺及血清內的氧化損傷,同時,推測直穗小檗果粉通過改善糖尿病大鼠體內氧化應激程度的效應,進而影響其糖代謝及脂代謝。

2.9 胰腺組織病理學觀察

圖5呈現了五個試驗組大鼠的胰腺組織病理學切片。在正常大鼠體內,其胰腺的胰島內,大量的胰島β細胞以固定的形狀和形態、定期的、均勻地進行排列(5A)。在糖尿病大鼠中,胰腺組織的由于受到低劑量的STZ的損傷,其胰島嚴重損害,包括出現有局灶性壞死和凋亡,組織收縮,β細胞溶解與β細胞數量的減少的現象(5B)。但是,此現象隨著格列本脲和直穗小檗果粉不同劑量的治療,發現以上病變明顯減少。不同劑量的直穗小檗果粉治療糖尿病大鼠后(5D和5E),可有效緩解了胰島架構的損傷,并伴隨著胰腺β細胞數量增加。相對于陽性對照組,其高劑量組的大鼠體內胰島損傷有更明顯的改善。說明直穗小檗果粉能一定程度地修復STZ對胰島造成的損傷,推測其損傷的修復可能與胰島細胞的氧化應激有關。即直穗小檗果粉通過改善糖尿病大鼠體內氧化應激程度的效應,進而可在一定程度上減輕胰島胰島β細胞的損傷及凋亡。

3 討論與結論

圖5 Ⅰ型糖尿病大鼠胰腺病理組織切片Fig.5 Histopathology examination of pancreas in diabetic rats(H&E stain)注:A為空白組;B為模型組;C為陽性藥組;D為直穗小檗果粉低劑量組;E為直穗小檗果粉高劑量組。

目前糖尿病的化學誘導造模法通常使用四氧嘧啶和鏈脲酶素(STZ),兩種均是具毒性的誘導型化學合成試劑[24]。Rakieten等[25]首次報道,采用STZ致胰島β細胞損傷進而導致糖尿病的模型。STZ,一種氨基葡萄糖-亞硝基脲,是一種DNA烷基化試劑,通常在實驗動物糖尿病模型建立中作為一種高毒性的β細胞誘導劑[26]。天然的鏈脲佐菌素是由一種鏈球菌產生的抗生素,與葡萄糖的化學結構具有很高的相似度,以至于葡萄糖轉運蛋白2(GLUT2)會將其當做葡萄糖轉運至細胞中,而胰島細胞內含有大量的GLUT2。STZ進入胰島細胞后通過DNA烷基化的方式損害DNA,對細胞產生毒性。對β細胞的DNA損傷將誘導ADP-核糖基化的活化,ATP去磷酸化反應增強,同時,可導致超氧化物自由基和羥基自由基的形成[27]。胰島β細胞的凋亡機制可能以這樣的途徑進行,因此,降低糖尿病患者體內的自由基,提高氧化應激能力可以作為一種有效的治療途徑,幫助減輕糖尿病并發癥。Junod等[28]報道,Wistar雄性大鼠腹腔注射STZ后,觀察到β細胞大量壞死,β細胞數量明顯減少。STZ所致的速發型糖尿病動物模型,接近于人的Ⅰ型糖尿病。本研究對雄性SD大鼠采用低濃度、單劑量腹腔注射STZ的方法誘導Ⅰ型糖尿病模型的建立。目前關于低劑量鏈脲酶素誘導大鼠患Ⅰ型糖尿病的發病機制尚未研究清楚,推測其發病機制類似于四氧嘧啶。

本研究通過動物試驗發現經STZ誘導的糖尿病大鼠血液中的葡萄糖水平、體重和血清胰島素在服用直穗小檗果粉后均有所改善。通過直穗小檗果粉的治療,糖尿病大鼠體重高于模型組大鼠,推測其原因是增加脂肪儲存或減少脂肪分解。此外,高血糖的降低可能是由于果粉增加了患病大鼠胰島素的敏感性。直穗小檗果粉可改善糖的代謝控制,使糖尿病大鼠獲得更高效的能量代謝,以抵抗高血糖癥;其次,直穗小檗果粉參與了脂代謝的控制,并且對其關鍵酶具有一定的調節作用;同時對血清和組織中的氧化應激酶以及MDA水平具有調節作用,推測其是改善胰島細胞損傷的主要機制之一。然而,直穗小檗果粉參糖代謝與脂代謝的控制,以及參與調節氧化應激的細胞機制尚未明確,需要進一步進行實驗以得出明確的結論。