不同來源乳中α乳白蛋白、β乳球蛋白和乳鐵蛋白含量分析

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(1.北京城市學院生物醫藥學部,北京 100083;2.北京市營養源研究所,北京 100069)

乳蛋白主要分為兩大類:酪蛋白和乳清蛋白,牛乳蛋白中酪蛋白含量約為80%,乳清蛋白含量約為20%。乳清蛋白在嬰兒的免疫系統調節、肌肉組織建立等起到了很重要的輔助作用[1-2]。乳清蛋白稱作蛋白之王,它是一種從奶類中提取的高營養、易吸收、內含多種活性成分的蛋白質,是世界公認的人體優質蛋白質補充劑之一[3-4]。乳清蛋白的主要成分包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白、乳過氧化物酶等。這些成分是人體中免疫系統的防御機制的一部分,在抑菌、抗病毒和調節人體免疫循環等方面發揮了積極作用[5-6]。

β-乳球蛋白是牛乳中的主要乳清蛋白,約占乳清蛋白的50%,是由162個氨基酸殘基、2個二硫基團(S-S)和1個硫氫基團(-SH)組成的一種分子量約18.3 kDa的小的球狀蛋白。β-乳球蛋白與葉酸結合,可以有效地增強其穩定性;與脂溶性維生素和脂肪酸等結合,可以改善產品的風味、促進營養物質的吸收;β-乳球蛋白也可以延緩某些脂肪酸和維生素的氧化降解,起到保護作用[7]。

α-乳白蛋白是乳清蛋白中第二豐富的組分,占牛乳清蛋白的20%。α-乳白蛋白在乳腺中合成,在乳糖的生物合成上作為輔酶參與作用[8]。α-乳白蛋白控制著乳腺中乳糖的含量,是泌乳階段的一個重要調節因子。另外,α-乳白蛋白也是必需氨基酸色氨酸和半胱氨酸的良好供體[9]。

表1 不同來源及加工方式的乳樣品Table 1 The milk samples from different sources and processing methods

乳鐵蛋白是乳清蛋白中的一種重要的非血紅素鐵結合糖蛋白,它是母乳中重要的具有多種生理活性的鐵結合糖蛋白[10],約占母乳乳清蛋白的26%,乳鐵蛋白因其獨特的結構及生物學功能,在強化機體鐵吸收、對抗病原體、免疫調節以及抗氧化等方面發揮著重要作用[11-12]。但并非乳汁所特有,在哺乳動物的很多外分泌物中都存在,如眼淚、唾液和精液等[13]。只是除乳中外,其他分泌物中含量甚微。因其晶體呈紅色,故也有學者稱之為紅蛋白[14]。乳鐵蛋白具有很多對人體有益的功能:抗菌、抗氧化、抗癌、調節免疫系統等[15]。因此,被認為是一種新型抗菌、抗癌藥物和極具開發潛力的食品和飼料添加劑,越來越多的受到國內外相關企業及研究者的重視[16]。我國在GB14880-2012《食品營養強化劑使用標準》將乳鐵蛋白列為了新型營養強化劑,并規定了其在相關乳制品中的含量標準。目前,我國并沒有建立相應的檢測標準[17-18]。

近年來隨著人們生活水平的提高,人們對乳及乳制品的需求量也越來越大,除了牛乳,羊乳、牦牛乳等乳制品也逐漸流入市場。目前系統地對不同來源不同物種奶中乳清蛋白的研究并不多,本研究采用高效液相色譜法串聯質譜外標法測定不同來源的羊乳、牦牛乳、牛乳中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白含量,分別分析其在不同乳中的差異。為嬰幼兒配方奶粉等食品加工提供數據基礎和技術思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

碳酸氫銨、氯化鈣、乙酸、硫酸、氫氧化鈉 均為分析純,北京化工廠;色譜純甲酸、乙腈 賽默飛世爾科技有限公司;二流蘇糖醇(DTT) Solarbio公司、碘代乙酰胺(IAA) Solarbio公司、牛胰蛋白酶(SIGMA公司);牛乳鐵蛋白特異肽段VDSALYLGSR、α-乳白蛋白特異肽段VGINYWLAHK、β-乳球蛋白特異肽段TPEVDDEALEK 純度≥95%,由寧波康貝生化有限公司制備。

UPLC I-CLASS XEVO液相色譜-串聯三重四級桿質譜聯用儀(帶電噴霧離子源) WATERS公司;TQCP124C全自動電子天平(十萬分之一) 日本A&D公司;MVS-1漩渦混合器 北京金北德工貿有限公司;Easypure純水系統 美國Barnstead公司;PS-60A超聲波振蕩器 深圳市深華泰實業有限公司；ZHWY-110X30往復式恒溫水浴搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；KJ2300全自動凱氏定氮儀 FOSS公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳類樣品的采集與處理 本研究通過市場采購和網購方式采集到來自不同產地包括巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳共24種,其中牛乳15種、羊乳6種、牦牛乳3種。詳情見表1。奶樣采集后4 ℃保存,3 d內測定。

1.2.2α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白含量的測定 乳類樣品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白含量檢測方法參考液相色譜質譜法[19-22]進行檢測。

1.2.2.1 樣品預處理 稱取2.5 g樣品溶液于100 mL容量瓶中,用水稀釋定容至刻度,混勻。移取200 μL稀釋液于小試管中,加入180 μL碳酸氫銨溶液,混勻,加入15 μL二硫蘇糖醇溶液,50 ℃恒溫反應30 min,取出冷卻,加入45 μL碘代乙酰胺溶液,避光靜止30 min,加入10 μL氯化鈣溶液和40 μL胰蛋白酶溶液,37 ℃恒溫酶解4 h,取出后加入10 μL甲酸,室溫靜止30 min,最后加入適量水,使酶解液總體積為1.0 mL,混勻后過0.22 μm濾膜,即為待測樣品供試液,供液相色譜質譜測定。

1.2.2.2 液相條件 色譜柱:硅烷基C18柱;流動相A:0.1%甲酸水溶液;流動相B:0.1%甲酸乙腈溶液;流動相流動速度:0.3 mL/min;色譜柱柱溫:40 ℃;試液溫度:10 ℃;進樣體積:5 μL。

1.2.2.3 質譜條件 毛細管電壓3.5 kV,錐孔電壓35 kV,脫溶劑溫度500 ℃,脫溶劑氣流量800 L/min,錐孔反吹氣流量30 L/hr,碰撞室壓力3.0×10-3mbar,低端分辨率1:2.5 V,高端分辨率1:15.0 V,離子能量1:0.5,低端分辨率2:2.8 V,高端分辨率2:15.0 V,離子能量2:1.0,離子源溫度:150 ℃,提取器壓力:3.0 V,入口透鏡電壓:0.5 V,碰撞梯度:1.0。

1.2.2.4 定性定量條件α-乳白蛋白特異肽段分子量1199.65,母離子為[M+2H]2+為601,子離子為355.2+/284.2+;β-乳球蛋白特異肽段分子量1244.50,母離子為[M+2H]2+為623.2,子離子為819.3+/918.4+。乳鐵蛋白特異肽段分子量1079.6,母離子為[M+2H]2+為540.9,子離子為595.3+/319.3+。

α-乳白蛋白分子量為14178、β-乳球蛋白分子量為18320、乳鐵蛋白分子量為76095.1,采用特異肽段外標法定量。

乳清蛋白含量(g/100 g)=[α-乳白蛋白含量(g/100 g)+β-乳球蛋白含量(g/100 g)]/系數(60%)。

1.2.3 不同乳中總蛋白含量 牛乳、羊乳、牦牛乳總蛋白含量采用GB 5009.5-2016食品中蛋白質的測定中第一法:凱氏定氮法進行測定。

1.3 數據處理

通過實驗收集到的原始數據經過Microsoft Office Excel 2013和SPSS 22.0整理分析。

2 結果與分析

2.1 α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白定量測定方法

本文采用酶解法同時測定乳品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白含量,以各功能蛋白的特異肽段定性定量子離子峰面積為橫坐標,濃度為縱坐標,得到標準曲線,各標準曲線方程相關系數均大于0.99,可滿足定量測定需要。各功能蛋白液相條件能夠很好的分離,如圖1～圖3。

圖1 α-乳白蛋白特異肽段譜圖Fig.1 α-lactoalbumin specific peptide segment spectrum

圖2 β-乳球蛋白特異肽段譜圖Fig.2 β-lactoglobulin specific peptide segment spectrum

圖3 乳鐵蛋白特異肽段譜圖Fig.3 Lactoferrin specific peptide segment spectrum

2.2 不同乳品中乳清蛋白含量比較

采集的牛、羊、牦牛乳樣品均以三平行平均值進行統計,羊奶乳清蛋白含量在0.287～0.484 g/100 g,牦牛奶乳清蛋白含量在0.447～0.601 g/100 g,牛奶乳清蛋白含量在0.454～0.578 g/100 g。通過對羊、牦牛、牛乳測定的乳清蛋白含量占總蛋白比分析后,可以看出三種乳類中的乳清蛋白量差異不明顯。其中,牛奶中的乳清蛋白量占總蛋白比例在三種乳類中最高(均值為16.2%),然后依次是牦牛乳(均值為14.81%)和羊乳(均值為13.28%)。乳清蛋白的實驗數據見表2。各個乳類測定的乳清蛋白占總蛋白比較見圖4。

圖4 不同乳品中乳清蛋白占總蛋白比例Fig.4 The percentage of whey protein content to total protein in different milk products

表2 不同乳品中乳清蛋白含量Table 2 Contents of whey protein in different milk samples

2.3 不同乳品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量比較

2.3.1 不同羊奶樣品間α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量 由圖5可得,同一樣品間數據平行性很好,但不同樣品間波動性較大,所以做羊奶整體平均數時采用舍極值取平均的公式計算,保障羊奶中蛋白含量的普遍性。結果得到羊奶中α-乳白蛋白含量在0.113～0.213 g/100 g范圍;而β-乳球蛋白含量約在0.110～0.174 g/100 g范圍內。

圖5 不同羊乳樣品間α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量Fig.5 Contents of α-lactoalbumin and β-lactoglobulin in different samples of goat milk

2.3.2 不同牦牛乳樣品間α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量 牦牛乳乳清蛋白樣品間α-乳白蛋白和β-乳球蛋白測定結果比較見圖6。從圖中可知,不同牦牛乳樣品間存在較大差異,牦牛乳中α-乳白蛋白的含量范圍在0.118～0.207 g/100 g;β-乳球蛋白的含量范圍在0.150～0.178 g/100 g。

圖6 不同牦牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量Fig.6 Contents of α-lactoalbumin and β-lactoglobulin in different yak milk

2.3.3 不同牛乳樣品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量 由圖7可看出,同一樣品間的三組數據平行性較好,但個別數據出現了單組差異性較大,并且不同樣品間β-乳球蛋白差異較大,所以在牛奶整體取平均數時,也采用舍極值取平均來保障牛奶中蛋白含量的普遍性。牛奶中α-乳白蛋白的含量在0.121～0.205 g/100 g范圍內;β-乳球蛋白含量在0.120～0.193 g/100 g范圍內。

圖7 不同牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量Fig.7 Contents of α-lactoalbumin and β-lactoglobulin in different milk

由于人乳與其他乳品的蛋白質構成存在差異,再加上嬰兒腸道和免疫系統發育尚不成熟,有一部分嬰兒會對乳品過敏。研究表明,β-乳球蛋白是牛乳的主要過敏原[22],本研究顯示,羊乳中β-乳球蛋白的含量最低,牦牛乳次之,牛乳最高,因此羊乳較牦牛乳、牛乳較更不易引起嬰兒過敏。

2.4 不同來源乳中乳鐵蛋白含量比較

由表3可以看出,羊奶乳鐵蛋白含量在2.15～9.90 mg/100 g,牦牛奶乳鐵蛋白含量在2.21～2.65 mg/100 g,牛奶乳鐵蛋白含量在1.21～3.27 mg/100 g。通過對三種乳類測定出的乳鐵蛋白含量占其總蛋白含量的比例分析,可得羊乳中的乳鐵蛋白含量最高,牦牛乳和牛乳的乳鐵蛋白量相差不多。如圖8可以看出,乳鐵蛋白占總蛋白比例由多到少依次是羊乳(約總蛋白量占0.124%)>牦牛乳(約總蛋白量占0.07%)>牛乳(約總蛋白量占0.06%)。本研究中羊乳中乳鐵蛋白濃度稍高,不同來源樣品間差異較大,可能與農場的養殖水平、飼料、飼養環境有關。

圖8 不同乳品中乳鐵蛋白占總蛋白比例Fig.8 The percentage of lactoferrin content to total protein in different milk products

表4 不同來源乳品α-乳白蛋白含量、β-乳球蛋白含量和乳鐵蛋白含量差異性分析Table 4 Differentiation of the contents of α-lactoalbumin,β-lactoglobulin and lactoferrin in milk from different sources

表3 不同乳品中乳鐵蛋白含量Table 3 Contents of lactoferrin in different milk samples

2.5 不同來源乳品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白含量比較

本文采集到牦牛乳、牛乳和羊乳共3種類型乳品。經檢測分析,3個地區的牦牛乳中α-乳白蛋白含量差異很大,最小值為0.118 g/100 g、最大值為0.207 g/100 g;β-乳球蛋白含量在3個地區牦牛乳中含量一致。15個牛乳中α-乳白蛋白含量差異較大,其范圍在0.121～0.205 g/100 g;β-乳球蛋白含量與α-乳白蛋白含量范圍接近,在0.120～0.193 g/100 g。6個羊乳樣品測定結果顯示,α-乳白蛋白含量大于牦牛乳和牛乳,在0.113～0.213 g/100 g,β-乳球蛋白含量差異不顯著,范圍在0.110 g/100 g～0.174 g/100 g。

3種類型乳品乳鐵蛋白含量差異顯著,含量范圍在1.21～9.90 mg/100 g(表3)。3個地區的牦牛乳中乳鐵蛋白含量一致,在2.21～2.65 mg/100 g。15個牛乳中乳鐵蛋白含量在1.21～3.27 mg/100 g。羊乳中乳鐵蛋白含量差異最顯著,最低值為2.15 mg/100 g,最大值為9.90 mg/100 g。總體來看,羊乳中乳鐵蛋白含量優于牛乳和牦牛乳。

3 結論

本研究對24種市售乳品的測定得到,不同來源乳品的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白、乳鐵蛋白和總蛋白含量存在差異。牦牛乳和牛乳的乳清蛋白含量接近,羊乳中乳清蛋白含量相對較低。但是,羊乳卻是良好的乳鐵蛋白來源,在三類乳源中含量最高。牦牛乳總蛋白含量明顯高于牛乳和羊乳。

GB 10765-2010規定,嬰兒奶粉中乳清蛋白含量要大于總蛋白的60%。本研究乳清蛋白含量和乳清蛋白占總蛋白比例結果可以為嬰兒乳粉等產品中乳清蛋白來源提供數據支持,乳鐵蛋白含量結果可以篩選更適宜的營養強化劑乳鐵蛋白原料來源。