核桃低聚肽對亞健康大鼠氧化應激和炎癥反應的影響

劉 睿,康家偉,珠 娜,張 亭,王天星,杜 倩,張 黎,李 勇

(北京大學醫學部公共衛生學院,北京 100191)

亞健康(Sub-health)是指處于疾病與健康之間的一種中間狀態,又稱為“次健康狀態”、“第三狀態”,根據其成因及表現,主要分為軀體性亞健康、心理性亞健康和社會交往亞健康狀態[1-2]。隨著社會競爭的日趨激烈、行為和生活方式的改變、環境污染等因素,亞健康人群呈逐年上升趨勢[3]。我國亞健康人群比例為60%～70%,其中處于疲勞型亞健康狀態的比例近35%,亞健康高發人群多為青壯年,年齡段位于30～50歲[4]。亞健康狀態不符合現代醫學有關疾病的臨床診斷標準的特點,且易向慢性非傳染性疾病方向發展,甚至是癌癥等重大疾病的征兆,嚴重威脅人類的健康。但由于亞健康尚屬于未病的范疇,且引起不適的確切原因未明,臨床上多采用對癥治療,常用藥物有消炎鎮痛藥類、抗抑郁藥、抗疲勞藥物等,但這些藥物多有副作用,不宜長期服用。因此,通過功能性食品防治亞健康的發生發展成為當今亞健康研究的新趨勢。

核桃(JuglansregiaL.)又稱胡桃、羌桃,胡桃科胡桃屬植物。我國是核桃的原產地之一,栽培歷史已有7000多年。明代的《本草綱目》記載:“核桃味甘性平微苦微澀,有補腎固精、健脾補血、通便潤腸、寧心安神等功效”。現代研究發現,核桃中不僅含有豐富的蛋白質、糖類、脂類成分,更含有人體需要的不飽和脂肪酸、VE、黃酮、葉酸、多酚類等多種生理活性成分[5]。核桃低聚肽(walnut oligopeptides,WOPs)是利用生物酶解技術從核桃蛋白中提取的小分子生物活性肽,近年來研究發現,低聚肽比單個氨基酸的吸收更有效,有效提高了蛋白質的吸收利用率[6]。現有研究發現核桃低聚肽具有提高記憶力[7]、抗輻射[8]、潤腸通便[9]、提高性功能[10]等多種生物活性。研究報道核桃肽可以延長實驗動物力竭游泳時間,加速乳酸消除,有效促進實驗動物疲勞的恢復和延緩疲勞的發生[11-12]。但尚未見核桃低聚肽防治亞健康的相關報道。本研究根據國內外文獻報道,通過復合因素即睡眠剝奪(中樞疲勞)與負重力竭游泳(外周疲勞)相結合,在運動疲勞的基礎上添加精神上的影響,建立亞健康大鼠模型[13-15],探討核桃低聚肽對亞健康的防治作用及其可能機制,為核桃低聚肽用于防治亞健康提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃低聚肽 淡黃色固體粉末,購自北京天肽生物科技有限公司提供,通過高效液相色譜法分析WOPs分子量及氨基酸組成,分子量小于1000 Da的低聚肽占86.5%,小于2000 Da的肽類總量高達96.5%,游離氨基酸含量為2.98 g/100 g,其中精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸含量較多;健康SPF級雄性SD大鼠 60只,8周齡,體重(200±20) g,由北京大學醫學部實驗動物中心提供(實驗動物許可證號:SYXK(京)2011-0039;實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2011-0012);丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low densitylipoprotein-cholesterol,LDL-C)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)檢測試劑盒 英科新創(廈門)科技有限公司;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin,IL-6)、白介素-1β(interleukin,IL-1β)和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)檢測試劑盒 北京麥格泰克科技有限公司。

Adventurer TM通用型分析天平 美國奧豪斯國際貿易有限公司;5804R高速冷凍離心機 德國艾本德股份公司;DZKW-4電熱恒溫水浴鍋 北京天林恒泰科技有限公司;AU400全自動生化儀 日本奧林巴斯株式會社;FSH-2A可調高速電動勻漿機 金壇市金南儀器廠;GNP-9080型隔水式恒溫培養箱 上海創奕科教設備有限公司;BMG FLUO star Omega多功能酶標儀 德國 BMG LABTECH公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物與分組 實驗大鼠飼養在北京大學醫學部實驗動物科學部,單籠飼養,自由飲食、飲水。適應性喂養一周后,進行適應性游泳訓練(水深50 cm,水溫(30±1) ℃;每日一次,每次10 min,連續3 d)。適應性游泳訓練結束后,根據體重將大鼠隨機分為6組,每組10只:正常對照組、模型對照組、核桃低聚肽(WOPs)低、中、高劑量組(220、440、880 mg/kg·bw,分別對應WOPs 1、WOPs 2和WOPs 3組)。正常對照組和模型對照組大鼠經口灌胃給予蒸餾水,核桃低聚肽組給予相應濃度受試物,灌胃量為1 mL/100 g。實驗期間,大鼠單籠飼養、自由飲水進食。

1.2.2 建立亞健康疲勞大鼠模型 分組結束后,采用睡眠剝奪+5%負重游泳的復合方式制備亞健康疲勞大鼠模型[13-15]:正常對照組大鼠正常飼養,其余四組大鼠放入盛有2.2 cm水深的動物籠中,迫使其保持站立的姿態不能睡眠從而導致疲勞。每籠1只,連續5 d,每日早晚各換水1次。造模期間,每日經口灌胃給予受試樣品一次,自由飲水進食,水溫維持與室溫相近(23±1) ℃。5 d后,各組大鼠于末次給予受試樣品1 h后[16],在鼠尾根部負荷5%體重的鉛皮,置于游泳箱中進行負重力竭游泳實驗(水深50 cm,水溫(30±1) ℃)。采用力竭判斷標準為大鼠游泳協調性顯著性下降、身體下沉、水淹沒鼻尖至再次浮出水面超過10 s[16-17]。記錄大鼠自游泳開始至力竭的時間,作為大鼠負重游泳時間。負重游泳結束后,采用乙醚麻醉處死大鼠,進行相關指標的檢測。

1.2.3 指標檢測

1.2.3.1 臟器系數的測定 負重游泳結束后,采用乙醚麻醉處死大鼠,稱量體重，然后分離肝臟、腎臟、腎周脂肪和附睪脂肪稱重(g)。稱量肝臟、腎臟、腎周脂肪及附睪脂肪重量(g),并根據公式計算臟體比和脂體比。

臟體比(%)=臟器重量×100/體重

脂體比(%)=(腎周脂肪重量+附睪脂肪重量)×100/體重

1.2.3.2 血清生化指標檢測 負重游泳結束后,采用乙醚麻醉處死大鼠,股動脈采血,在4 ℃ 3000 r/min離心10 min 吸取上清,使用全自動生化儀檢測血清ALT、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C和血尿素氮BUN含量。

表1 核桃低聚肽對大鼠體重和臟器系數的影響Table 1 Effects of WOPs on the body weight and organ index in

1.2.3.3 ELISA法檢測血清氧化應激和脂質過氧化指標 血液3000 r/min離心10 min后,分離血清,根據試劑盒說明書用 ELISA 法檢測血清SOD、GSH、GSH-Px和MDA含量。

1.2.3.4 ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6、IL-1β和LPS水平 血液3000 r/min離心10 min后,分離血清,根據試劑盒說明書用 ELISA 法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和LPS的水平。

1.3 數據處理

表3 核桃低聚肽對大鼠血清生化指標的影響Table 3 Effects of WOPs on serum biochemical parameters in

2 結果與分析

2.1 核桃低聚肽對亞健康大鼠體重、臟器系數的影響

如表1所示,大鼠初始體重各組間無顯著性差異(P>0.05)。造模5 d后,模型組大鼠體重極顯著低于正常對照組(P<0.01)。與正常對照組相比,模型對照組大鼠肝臟重量、腎周脂肪、附睪脂肪和脂體比均極顯著降低(P<0.01),腎臟重量、腎體比顯著降低(P<0.05)。與模型對照組相比,3個核桃低聚肽組除了低劑量組(WOPs 1)肝臟重量與附睪脂肪重量高于模型對照組(P<0.05),其它指標差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 核桃低聚肽對亞健康大鼠負重游泳時間的影響

在負重力竭游泳測試中,模型對照組大鼠游泳時間極顯著低于正常對照組(P<0.01)。核桃低聚肽組大鼠游泳時間長于模型對照組,其中核桃低聚肽中劑量組(WOPs 2)與模型對照組相比差異顯著(P<0.05),高劑量組(WOPs 3)具有極顯著差異(P<0.01)。

表2 核桃低聚肽對大鼠負重游泳時間的影響Table 2 Effects of WOPs on weight-loaded forced swimming endurance time in

2.3 核桃低聚肽對亞健康大鼠血清生化指標的影響

血清ALT、AST水平是評價早期肝損傷的常用指標。由表3可知,與正常對照組相比,模型對照組ALT、AST含量均極顯著升高(P<0.01)。核桃低聚肽低劑量組和中劑量組ALT、AST含量顯著低于模型對照組(P<0.05或P<0.01)。血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量在各組間均無統計學差異(P>0.05)。模型對照組和核桃低聚肽各劑量組BUN水平較正常對照組均極顯著升高(P<0.01),但核桃低聚肽劑量組與模型對照組相比無統計學差異(P>0.05)。

2.4 核桃低聚肽對亞健康疲勞大鼠氧化應激的影響

表5 核桃低聚肽對大鼠血清炎癥因子和脂多糖的影響Table 5 Effects of WOPs on inflammatory cytokine and lipopolysaccharide levels in

如表4所示,與正常對照組相比,模型對照組SOD、GSH活性顯著降低(P<0.05),表明亞健康大鼠體內發生了一定程度的氧化應激損傷。與模型對照組相比,核桃低聚肽高劑量組SOD活性顯著增高(P<0.05);3個核桃低聚肽劑量組GSH活性均極顯著高于模型對照組(P<0.01)。GSH-Px含量(核桃低聚肽高劑量組除外)在各組間均無統計學差異(P>0.05)。

表4 核桃低聚肽對大鼠氧化應激指標的影響Table 4 Effects of WOPs on serum oxidative stress

2.5 核桃低聚肽對大鼠過氧化產物的影響

如圖1所示,與正常對照組相比,模型對照組MDA含量顯著增高(P<0.05)。與模型對照組相比,核桃低聚肽各組MDA含量均降低,其中高劑量組大鼠血清MDA含量顯著低于模型對照組(P<0.05)。

圖1 WOPs對大鼠血清MDA含量的影響Fig.1 Effects of WOPs on serum

2.6 核桃低聚肽對亞健康疲勞大鼠細胞因子的影響

如表5所示,與正常對照組相比,模型對照組血清TNF-α顯著升高(P<0.05)、IL-1β水平均極顯著升高(P<0.01)。與模型對照組相比,3個核桃低聚肽干預組TNF-α、IL-1β水平均顯著低于模型對照組(P<0.05或P<0.01);核桃低聚肽高劑量組IL-6含量顯著低于模型對照組(P<0.05)。LPS水平在各組間均無顯著性差異(P>0.05)。

3 討論與結論

國內外對亞健康問題的研究中面臨的重點問題是缺乏成熟的實驗動物模型,很多研究借鑒疲勞動物模型來制備亞健康動物模型,如懸吊、束縛、游泳、跑臺等,但跑臺運動易引起實驗動物足部和尾部的損傷,懸吊和束縛作為應激刺激與人類疲勞的應激原因明顯不同,不具備相似性。而且上述單一因素造模無法確定模型是否處于亞健康狀態,不宜應用到亞健康動物模型的制備中[18]。大鼠游泳疲勞模型是目前國內外比較公認的實驗動物疲勞模型,采用5%負重力竭游泳模型,力竭是疲勞長期積累而引起機體功能紊亂的病理狀態,負重力竭游泳時間的長短可以反映動物疲勞的程度,是評價實驗動物抗疲勞能力的有效指標[19]。本研究在以往研究單一因素及復合因素建立亞健康模型的基礎上,綜合考慮亞健康狀態者的疲勞、失眠、活力降低等主要表現,采用睡眠剝奪(中樞疲勞)與負重力竭游泳(外周疲勞)復合造模法,在運動疲勞的基礎上添加精神上的影響,來制備亞健康疲勞大鼠模型,并在既往研究和預實驗的基礎上,設計了高、中、低3個WOPs劑量組(220、440、880 mg/kg·bw)。研究發現與正常對照組相比,模型對照組大鼠體重、體脂比明顯下降,精神狀態差、易疲勞、易激惹。核桃低聚肽各劑量組大鼠負重游泳時間的持續時間均高于模型對照組,其中核桃低聚肽中、高劑量組大鼠負重游泳時間相比模型對照組顯著延長(P<0.05或P<0.01),表明核桃低聚肽有效增強了亞健康疲勞大鼠體力和運動耐力,起到了防治亞健康疲勞的效果。

研究發現,在力竭性運動過程中,血液的重新分布、能源物質的消耗和代謝產物的堆積等,都會不同程度地影響肝臟組織的結構和功能[19]。機體內含有20余種轉氨酶,當肝細胞被破壞時,轉氨酶便會進入血液,通過測定血清或血漿中轉氨酶的活性,即可反映肝細胞受損情況,其中以ALT和AST的升高最為敏感。本研究結果顯示,模型對照組大鼠血清ALT、AST水平相較正常對照組極顯著升高(P<0.01),說明模型對照組大鼠肝功能出現了損傷,聶曉莉等[20]的研究中也出現了相似結果。在本研究中,核桃低聚肽干預后，低、中劑量組大鼠血清ALT、AST水平顯著降低(P<0.05或P<0.01),說明核桃低聚肽對亞健康大鼠出現的肝損傷有一定的保護作用。血清尿素氮是腎功能能量代謝的產物。較長時間運動后,當糖、脂肪代謝不能供給機體足夠的能量時,蛋白質和氨基酸分解代謝加強,導致機體中血尿素氮含量增加。體內尿素氮和身體耐力之間呈正相關,即身體承受運動耐力越差,尿素氮水平增加越多[21]。模型對照組和核桃低聚肽劑量組BUN水平較正常對照組均極顯著升高(P<0.01),但各模型組間無統計學差異(P>0.05)。此外血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平在各組間也未發現統計學差異(P>0.05),提示核桃低聚肽對亞健康大鼠腎功能和脂代謝的影響尚不明確,還有待進一步研究。

亞健康狀態與氧化應激反應關系密切,當活性氧分子水平超過機體清除能力時,大量活性氧蓄積,造成DNA、蛋白質、脂質及某些重要酶的損害,同時力竭性運動時機體自由基產生增多,脂質過氧化程度也會增加,加重對機體的損傷[22]。SOD是機體清除自由基的首要物質,可抵制氧自由基對細胞造成的損害,并及時修復受損細胞;GSH是機體重要的抗氧化物質之一,它能敏感有效地反映機體氧化應激狀態;GSH-Px是體內廣泛存在的一種催化過氧化物分解的酶,可使脂質過氧化物分解成相應的醇類,從而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用[23-24]。在疾病或應激狀態下,SOD活性、GSH含量、GSH-Px活性均會下降。本研究結果表明,模型對照組SOD、GSH活性顯著低于正常對照組(P<0.05),表明亞健康大鼠體內發生了氧化應激損傷,說明核桃低聚肽在一定程度上緩解了亞健康引起的氧化應激損對機體的損傷。

MDA作為脂質過氧化的終產物具有很強的細胞毒性,可以特異的反映機體內脂質過氧化的程度,間接反映出細胞損傷的程度[25]。本研究結果顯示模型對照組MDA含量顯著高于正常對照組(P<0.05),說明經模型組大鼠體內發生了明顯的脂質過氧化反應。核桃低聚肽干預后,高劑量組大鼠血清MDA含量顯著低于模型對照組(P<0.05),提示核桃低聚肽干預可顯著降低亞健康狀態引起的大鼠體內脂質過氧化反應。核桃低聚肽可在一定程度上抑制亞健康引起的機體過度氧化應激和脂質過氧化反應,從而起到保護機體免受氧化應激損傷的作用,這也與之前對核桃低聚肽具有抗氧化作用的研究相符[26]。

疲勞是亞健康的主要表現之一,疲勞狀態下炎癥反應在體內廣泛存在,大量細胞因子產生和累積加重了機體的損傷[27]。細胞因子由循環系統和組織內的白細胞及其它細胞產生,包括IL-1β、IL-6、TNF-α等,是炎癥反應時免疫系統和神經內分泌系統之間的重要媒介物質。IL-1除了能通過刺激蛋白酶的合成影響肌肉炎癥反應外,還可以誘導其它細胞因子的表達;TNF-α的作用與IL-1有交迭,能增加白細胞的附著性、激發白細胞的功能和增加巨噬細胞的活性,與炎癥反應、脂質代謝和細胞死亡都密切相關;IL-6是另一個重要的促炎因子[28-29]。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁外模的主要組成部分,一旦進入血液被免疫系統識別,便會引發內毒素血癥。本研究結果顯示,模型對照組亞健康大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均極顯著高于正常對照組(P<0.01),但血清LPS水平在各組間無顯著性差異(P>0.05),表明亞健康模型大鼠體內發生了炎癥反應,刺激了炎癥因子的過量產生,但尚未觀察到腸源性內毒素血癥的發生。核桃低聚肽劑量組TNF-α、IL-1β水平均顯著低于模型對照組,高劑量組IL-6含量顯著降低(P<0.05或P<0.01),表明核桃低聚肽可在一定程度上改善機體炎癥反應,具有一定的抗炎作用。

綜上所述,本研究通過模擬亞健康相關發生發展因素,使大鼠站立于水盒中連續5 d,并結合負重力竭游泳實驗,制備了亞健康疲勞大鼠模型。核桃低聚肽的干預能夠明顯提高亞健康大鼠力竭游泳時間,改善模型大鼠血清轉氨酶水平異常,提高抗氧化酶活力和抗氧化物質含量,降低脂質氧化產物水平,抑制血清炎癥因子水平的升高,從而延緩和減輕了亞健康狀態對機體的傷害,提示核桃低聚肽能夠較好地對抗亞健康,這位改善亞健康的臨床研究提供了科學依據。但仍有許多問題有待進一步探討。其一,動物模型目前并沒有統一定論,造模方式各不相同,穩定性、相似性、可重復性還有待加強,因此亟待建立成熟的亞健康動物模型;其二,目前關于核桃低聚肽的研究相對較少,還需繼續優化劑量設置,進行更深入的研究。此外也需要人群研究進一步證實其對亞健康狀態的改善效果及適宜劑量。