發酵食品工業中的生物安全性評價

黃曉棠,于宏偉,郭潤芳

(河北農業大學食品科技學院,河北保定 071000)

《國民營養計劃(2017-2030年)》、《“健康中國2030”規劃綱要》的實施使大健康產業尤其是功能食品、保健食品行業發展勢頭迅猛,大量有益健康的功能食品出現在市場上,其中生物活性肽、膳食纖維、高蛋白、不飽和脂肪酸、益生菌和益生元、酵素等備受青睞。2019年最新統計結果顯示,2018年我國益生菌產品市場規模達700億元,預計2020年我國益生菌市場規模將突破800億元。因此,發酵食品行業迎來前所未有的發展機遇,新型發酵產品尤其是益生菌和酵素已然成為食品工業的新寵。

人類使用發酵方法加工或保存食品以及食用發酵食品有著悠久的歷史。發酵食品因其獨特的感官特性、營養價值和利于貯藏等特性而在全球各地備受歡迎,并且微生物發酵產生的功能活性物質,有促進腸內營養吸收和消化道健康的有益生理功能,增強認知和神經保護作用,改善人類亞健康狀態[1-3]。但發酵食品工業也因此面臨著巨大的挑戰,那就是食品安全問題。食品在發酵過程中,也會產生一些副產物,有些副產物具有生物危害性,甚至對人體健康有潛在危害。尤其是傳統發酵食品,通常是自然發酵工藝,發酵過程較難控制,有害微生物存在將直接導致安全風險。因此,發酵食品工業在注重食品保健功能的同時,有必要對發酵食品的安全性進行評價,這對于保障健康食品,推動健康中國有重要意義。本文對發酵食品的安全性問題、生物安全性評價以及對發酵食品安全性的展望進行了論述,以期對發酵食品工業以及專業領域的研究人員提供一定的參考。

表1 發酵食品類型、產品、發酵微生物以及其功能特性Table 1 Fermented food types,products,fermenting microorganisms and their functional properties

1 發酵食品

發酵食品常用的微生物有酵母菌、乳酸菌、醋酸菌、霉菌等;利用這些微生物發酵的食品通常分為六類,發酵產品也多種多樣。表1列舉了發酵食品類型、產品、主要發酵微生物以及其功能特性。

2 發酵食品的生物安全性問題

發酵食品是否安全,與發酵菌株和發酵工藝有密切關系。一般來說,純種發酵工藝條件可控,具有較高的安全性。而傳統發酵食品就不可避免的存在一些安全性問題。如發酵過程中產生有毒有害代謝產物及雜菌污染等問題。因此,傳統發酵食品的生物安全性問題不容忽視,應引起高度重視。

2.1 發酵菌株的安全性

發酵食品是經發酵菌株代謝而制成的,發酵菌株的安全性直接影響到發酵食品的安全性。菌株對人體的致病性、是否產生有毒代謝物、是否攜帶抗藥基因、溶血基因是發酵菌株首要的安全性問題;其次,隨著新食品資源的開發利用,導致新菌株不斷涌現,這些菌株安全性得不到保障;即便是在投產時認為安全的菌株,在傳代使用過程中,菌株可能會發生退化和變異;最后,基因工程或DNA重組技術已經用來改良不同生產菌株的屬性,因此要對使用基因重組技術的發酵食品的安全性進行重新論證。

2.2 發酵過程的副產物

發酵過程中可能會產生一些副產物,如亞硝酸鹽、真菌毒素、生物胺等。如在蔬菜腌漬發酵時,會產生副產物亞硝酸鹽,長期食用會導致胃癌[16];白酒在發酵過程中可能會產生甲醇等副產物,而這是在生產過程種不可避免的,若飲用甲醇含量高的白酒將會對人體產生危害[17];肉制品中某些發酵微生物可能含有氨基酸脫羧酶,使肉制品中的氨基酸脫羧成生物胺,若過量攝入會有不良反應,特殊情況下生物胺中毒會引起人體器官損害[18]。

2.3 發酵過程中雜菌污染

發酵食品在發酵過程中,可能會被微生物雜菌污染。如在腌漬菜發酵過程中可能會出現膨脹現象,這是因為受到一些產氣微生物的影響,包括酵母菌,甚至是大腸桿菌。自然發酵的腐乳可能會出現變紅或者變臭等現象,這是因為可能被枯草桿菌、雷黏質沙雷氏菌等雜菌污染[19]。食源性致病菌是全球性重大公共衛生問題,若食用含有致病菌的發酵食品,可能會導致人體患感染性或中毒性疾病,給公眾健康帶來安全隱患。

食品發酵過程中產生的生物危害物,嚴重影響了發酵食品的安全性,危害人體健康,亟須采取切實有力的措施予以解決。

3 發酵食品的生物安全性評價

由于發酵食品生產過程中有害微生物或發酵菌株的有害產物均可能有一定安全隱患,因此,準確科學的對發酵食品進行風險識別和安全性評價是控制食品質量安全的前提和保障。

3.1 發酵食品的風險識別

與食品相關的危害,要經過國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission,CAC)的風險分析程序對潛在風險進行評估,食品風險分析要以國際食品法典委員會的一般性決策以及《國際食品法典風險分析工作準則》作為指導,應用風險分析對化學性危害、微生物危害和營養因素進行評估。

對發酵食品中生物危害進行有效分析時,需要完善的風險評估模型,準確的分析存在的風險隱患因子,進而采取有效的措施解決危害。參照CAC對食品安全風險評估的解釋,發酵食品的風險評估可以是指對特定人群在特定時期內暴露于發酵食品中的生物性、化學性等危害所產生的可能不良影響以及與健康相關的風險特征進行的描述。目前應用最廣泛的評估手段之一是現代微生物風險評估技術(microbiological risk assessment)。該技術主要包括危害識別﹑危害描述﹑暴露評估﹑風險描述 4個步驟(見圖1)[20-21]。

這一方法不僅適合發酵食品中的食源性致病菌的污染風險評估,也可用于發酵有害代謝產物的風險評估。在很多情況下,用這種評估方法未觀察到不良反應的暴露水平,可以通過設定適當的安全系數來制定人類的安全攝入水平。

隨著科技水平的不斷進步和時代的發展,用來識別食品安全風險新技術層出不窮,如用貝葉斯模型與Meta分析技術結合,評估食品質量和安全狀況,并識別風險食品[22]。此方法是評估食品風險的有用工具,可評估食品的質量和安全水平。

圖1 現代微生物風險評估技術Fig.1 Modern microbiological risk assessment techniques

3.2 發酵菌株的安全性評價

發酵菌株的安全性直接影響到發酵食品的安全性。為了確保菌株對人體安全可靠,國內外很多國家都制定了自己國家的菌株安全性評價體系。

3.2.1 國內外菌株安全性評價體系 FAO/WHO聯合專家組在一次會議上制定“食品中益生菌評估導則”,該導則提供了一個對益生菌的安全性全面評估的方法,包括:抗生素耐藥性試驗、代謝產物毒性檢測試驗、毒理學評價、溶血性評價以及體外有效評價等[23]。雖然各國所使用益生菌的安全性評價方法各不相同,但總體還是參考這個導則進行評價。

美國對菌株的使用和管理比較嚴格。新的微生物菌株必須經過GRAS(generally recognized as safe)認可后才能被應用[24],此認可不是由美國食品藥品管理局(U. S. Food and Drug Administration,FDA)進行,而是由申請人組織專家評估其菌株的安全性,如果符合GRAS的要求,就可以向FDA通報,FDA只評估通報材料是否可靠[25]。整體來說,美國主要采用“企業自我認可,FDA備案制”對菌株進行安全評估,并使用自己國家相應的標準約束,定期備案更新。

歐洲食品安全委員會(European Food Safety Authority,EFSA)規定菌株安全性評價包括:菌株的組成、營養價值、固有特性研究、動力學研究等,菌株的其它方面也要根據法規規定的原則和程序進行評定[24]。EFSA建立了安全資格認證(Qualified Presumption of Safety,QPS)體系,新的微生物菌株應用前必須經過此體系的評估,評估包括4個方面:分類學地位、相關信息、致病性及最終用途[26]。經過認可的微生物菌株會被收錄到QPS列表里,且每年更新一次。

相比世界其他國家,我國對菌株的管理比較落后,基本采用行政審批方式。原衛生部在2010年公布了《可用于食品的菌種名單》[27]、2011年公布了《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》[27],若要使用名單上沒有的菌株,必須向相關部門申請并提交一系列材料,經部門組織專家評審和審批后,符合相關要求的菌株會以公告的形式公布。目前,我國已經批準可用于食品工業生產的菌種共計35種,包括雙歧桿菌、乳桿菌、葡萄球菌、乳酸乳球菌等[28]。

各國對發酵菌株的安全性評價方法、評價指標不同,管理制度也不同,因此建立統一的安全性評價系統方法是全世界各國亟待解決的問題。

3.2.2 生物安全性評價

3.2.2.1 菌株抗藥性評價 很多研究報道,發酵食品發酵生產過程中均有乳酸菌存在,而有研究表明乳酸菌可能會含有耐藥基因,一旦含有耐藥基因的細菌進入人體腸道,可能會發生耐藥基因水平轉移,從而導致人體耐藥。因此,對發酵食品的發酵菌株進行耐藥性分析及其水平轉移是很有意義的。

目前,抗藥性評價試驗方法主要包括抗生素敏感試驗和檢測耐藥基因及其水平轉移性。抗生素敏感試驗主要有平板藥敏紙品擴散法、打孔法、肉湯稀釋法、E-test法等,各有其優缺點[29];而耐藥基因檢測及水平轉移檢測則是用特異性引物利用PCR技術檢測菌株的抗藥性基因,再用濾膜雜交法對抗藥性基因的做可轉移性分析。Casado等[30]沒有檢測到具有抗生素抗性菌株的相關抗性基因;Hummel 等[31]研究發現一些菌株對氯霉素不耐藥,但具有耐氯霉素基因。這些說明,含有耐藥基因的菌株不一定表型表現抗性,耐藥基因可能不表達;而不含耐藥基因的菌株表型不一定表現敏感。另外,判斷菌株耐藥界值不一定準確,區分菌株耐藥敏感存在質疑。

3.2.2.2 菌株代謝產物毒害性評價 有些菌株代謝后會產生一些有毒害作用的物質,如吲哚、亞硝酸鹽類、生物胺類、D-乳酸、溶血素等。這些代謝產物在人體內大量存在時,將導致人體致病或死亡。

a.氨基脫羧酶活性檢測

具有氨基脫羧酶活性的細菌能將食品中氨基酸脫羧形成生物胺,若人體大量積累會引起中毒。檢測氨基脫羧酶方法有氨基酸脫羧酶試驗培養基檢測、試劑盒檢測、比色法等。Marino等[32]對分離自奶酪里的乳酸菌進行氨基脫羧酶活性檢測,結果表明氨基脫羧酶活性在分離菌株中廣泛存在;Moreno[33]對分離自不同食物中的78株菌株進行氨基酸脫羧酶檢測,其中1株菌含有組氨酸脫羧酶,7株菌含有酪氨酸脫羧酶,56株菌含有精氨酸脫羧酶。

b.D-乳酸檢測

根據乳酸旋光性不同,分為D-乳酸和L-乳酸,人體內只含有能分解L-乳酸的酶,若人體D-乳酸含量過多時,會引起代謝紊亂,甚至會引起D-型乳酸血癥。D-型乳酸的檢測方法主要有試劑盒檢測、自動生化分析儀(Technicon RA-XT autoanalyzer)檢測、酶法和高效液相色譜法。王夢姣[34]從馬奶中分離出7株腸球菌屬乳酸菌,并對D-乳酸檢測,結果表明有5株菌檢測到含有少量的D-乳酸。

c.生物胺檢測

生物胺存在于各種發酵食品中,主要包括色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺等,低濃度下生物胺對許多生理功能至關重要,若人體大量吸收會引起中毒或身體不適癥狀[35]。生物胺的檢測方法有很多,目前主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、傳感器法、毛細管電泳法等[36]。但目前還沒有明確的監管標準來監測發酵食品中的生物胺含量。FDA規定了水產品的組胺指導水平為50 mg/kg(FDA,2011),EFSA規定了水產品和食品中組胺含量不得高于100 mg/kg。韓國和中國分別限制了海產品組織中的組胺含量,分別為200和200～400 mg/kg[37]。

表2 發酵食品中的生物胺含量Table 2 Biogenic amine content in fermented foods

表2匯總了近年來國內外研究學者檢測不同來源發酵食品中生物胺含量[38-42],盡管報道的發酵食品中生物胺含量的范圍變化很大,但大多數食品含有潛在危險水平的生物胺濃度。為了確保發酵食品的安全性,需要進一步努力改進食品工藝過程,同時進行風險評估,以及制定管理發酵食品生物胺含量的法規。

3.2.2.3 菌株溶血性評價 微生物溶血有3種類型:α-溶血、β-溶血、γ-溶血,菌株是否溶血可以用血平板劃線來檢測,是否含有溶血基因用特異性引物通過PCR擴增技術檢測。若發酵菌株有溶血現象,菌株可能會含有溶血素或者溶血基因。溶血素能夠溶解細胞,直接損傷機體組織,因此會誘導許多疾病的發生。Baumgartner等[43]研究表明一些乳酸菌能夠表達某些溶血素,存在一定的安全隱患。

Semedo等[44]研究了腸球菌屬的溶血能力和溶血基因,分別在10和14種中發現了β-溶血和cyl基因,表明食品分離株具有毒力潛力,應加強對其安全性評估。

3.2.2.4 毒理學評價 國際上毒理學評價主要包括:動物急性毒性試驗,30 d喂養試驗及三項致畸致突變試驗。Yakabe 等[45]用短乳桿菌KB290對小鼠進行口服劑量毒性試驗,結果觀察到小鼠無不良反應也無死亡現象。Lu等[46]對新型菌株Phylloporiaribis的發酵菌絲體通過喂養小鼠檢測急性和亞慢性毒性,結果小鼠死亡率、總體病理學、組織學、血液學和血液化學均沒有影響,食物消耗也沒有劑量依賴性變化,這說明急性毒性和亞慢性毒性結果是安全的。

4 展望

隨著技術的進步和人類對健康飲食的需求,發酵食品越來越受到人們的青睞。預測2019-2023年,全球發酵食品和飲料市場的復合年增長率(CAGR)將達到7.2%。而且一些傳統的發酵食品已從其所在地進入跨國主食。然而大多數傳統發酵食品是在不受控制和不衛生的條件下生產的,這必然阻礙其進入新市場。因此,發酵食品的安全性將會直接影響發酵食品工業的健康發展。

從目前的發酵食品安全問題可能出現的緣由來看,今后發酵食品工業需要多方面實施安全舉措。首先,國家應加強菌種標準化管理,建立一套菌株的安全性評價方法,促進我國菌株研究和應用的科學健康發展;其次,國家、食品企業、科技人員之間要加強風險交流,不斷完善我國發酵食品安全性評價方法。另外,再吸收西式發酵食品技術的基礎上,要結合我國的傳統發酵工藝,改良現代發酵工藝。同時,也應有目的性的改善食品加工工藝、規范技術標準。總之,我們在注重食品營養功能的同時,也要重視安全問題,只有這樣才能實現健康中國夢。