聚乙二醇型超支化聚酯胺的制備及表征

高 翔， 羅 靜， 錢佳怡， 梁 雪， 張一帆， 李小杰， 陳明清

（江南大學化學與材料工程學院，合成與生物膠體教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

超支化聚合物是繼線形、支鏈形和交聯聚合物之后一類新型的合成高分子[1,2]。與線形聚合物不同，超支化聚合物具有高度支化、三維橢球狀結構、表面官能團豐富等與樹枝狀聚合物類似的特點，能包埋和化學鍵合客體分子，并可以進行功能改性。由于其獨特的分子結構、物理化學性質以及簡單的合成步驟，超支化聚合物被廣泛關注[3,4]，在納米載體、催化、光電材料等領域已經展現了巨大的應用潛力[5,6]。

近年來，生物相容性好、具備生物降解能力的超支化聚合物的合成及應用已經成為研究熱點[7]。國內外科學家們通過對超支化聚合物分子結構進行設計，構筑了很多可生物降解的超支化聚合物。科學家們合成了可在pH、氧化還原、蛋白酶等作用下降解的超支化聚合物，包括聚縮酮羥基醚[8]、聚酰腙[9,10]、聚磷酸酯[11-13]、聚多肽[14]等超支化聚合物，研究了它們的自組裝行為，以及在藥物輸送領域的應用。在基因治療研究方面，科學家們通過將二硫鍵[15-17]或者酯鍵[18]引入超支化聚合物骨架，合成了可生物降解的超支化聚（酰胺-胺）和超支化聚酯胺，與不能生物降解的超支化聚乙烯亞胺（HPEI）相比，它們的細胞毒性大大降低，提高了超支化聚合物在基因治療應用中的安全性。其中超支化聚酯胺大多采用碳鏈的二丙烯酸酯類化合物作為A2單體（含有兩個A 基因的單體，其余類推）通過邁克爾加成聚合反應制得，此類超支化聚酯胺的水溶性和生物相容性較差，而聚乙二醇（PEG）是一種用途廣泛的醚類高分子化合物，具有良好的水溶性和生物相容性，在生物體內能溶于組織液中，能被機體迅速排出體外而不產生毒副作用，而且當把PEG 和其他分子偶合時它的許多優良性能也會隨之轉移到結合物中[19，20]。利用PEG 對超支化聚酯胺表面進行改性，可使其水溶性得以改善。朱新遠等[21]利用聚乙二醇二丙烯酸酯的A2單體和胺類的B4單體通過邁克爾加成聚合反應合成了端胺基的超支化聚酯胺并用于基因轉染領域，但此A2+B4聚合方法會產生凝膠化現象，不適用于合成端基為丙烯酸酯的超支化聚合物。

本文首先以含PEG 長鏈的聚乙二醇二丙烯酸酯為A2單體，N-乙基乙二胺為B'B2單體，合成了表面含丙烯酸酯鍵、骨架含PEG、內部含叔胺的具有三維橢球狀結構的超支化聚酯胺。然后利用咪唑中的胺基與丙烯酸酯鍵的邁克爾加成反應，對超支化聚酯胺進行功能化改性，并對改性后超支化聚酯胺的化學結構和分子組成進行了表征，初步研究了其水溶性和pH 響應性。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）：化學純，西格瑪化學試劑有限公司；N-乙基乙二胺、N-甲基咪唑：化學純，梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；咪唑、二甲基亞砜（DMSO）、氯仿、無水乙醚：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 測試與表征

核磁共振（NMR）譜儀（瑞士Bruker 公司AVANCE 400 MHz 型）：以DMSO-d6或CDCl3為溶劑，四甲基硅氧烷為內標；傅里葉紅外（FT-IR）光譜儀（中國賽默飛世爾科技公司Nicolet iS50 型）：采用溴化鉀涂膜制樣，波數范圍500～3 000 cm-1，分辨率為2 cm-1；凝膠滲透色譜儀（美國沃世特公司Waters GPC 486 型）：以四氫呋喃（THF）為流動相，PEG 為標準樣；Zeta 電位及納米粒度分析儀（美國布魯克海文儀器公司 Zeta PALS 型）：采用鈀電極測量，掃描時間5 min；GPC-MALLS 多角度激光散射系統（美國懷雅特技術公司DAWN HELEOS II型）：以N，N-二甲基甲酰胺為流動相，樣品質量濃度為10 mg/mL。

1.3 實驗步驟

1.3.1 超支化聚酯胺的合成 向圓底燒瓶中加入PEGDA（0.02 mol）、30 mL DMSO（0.2 g/mL），在60 ℃下攪拌均勻并且通氮排除空氣，將N-乙基乙二胺（0.882 g，0.01 mol）加入到燒瓶中，避光反應24 h，得到超支化聚酯胺。依據原料PEGDA 的數均分子量250 和575，將樣品分別標記為HBPAE-250 和HBPAE-575。合成路線如圖1 所示。

1.3.2 咪唑功能化超支化聚酯胺（HBPAE-imidazole）的合成 向100 mL 圓底燒瓶中加入PEGDA（Mn=250，5.000 g，0.02 mol）、30 mL DMSO，在60 ℃下攪拌均勻并且通氮排除空氣，將N-乙基乙二胺（0.882 g，0.01 mol）加入到燒瓶中，避光反應24 h。將N-甲基咪唑（0.164 g，2 mmol）、咪唑（2.042 g，0.03 mol）加入燒瓶中，并升溫至70 ℃，避光反應24 h。反應結束后將反應溶液在無水乙醚中沉淀、氯仿溶解，沉淀-溶解3 次，最終旋轉蒸發得到黃色黏稠液體HBPAE-imidazole 6.235 g，產率為78.69%。

圖 1 超支化聚酯胺的合成路線Fig. 1 Synthesis route of hyperbranched poly(amino-ester)

2 結果與討論

2.1 超支化聚酯胺的合成

由PEGDA 和N-乙基乙二胺合成超支化聚酯胺的合成機理如圖2 所示。由于N-乙基乙二胺中伯胺的反應活性高于仲胺，所以雙鍵會先與伯胺進行邁克爾加成反應，生成AB2型中間體，進而發生AB2型單體的自縮聚，最終生成超支化聚酯胺。

圖 2 超支化聚酯胺的合成機理Fig. 2 Synthesis mechanism of hyperbranched poly(amino-ester)

反應過程中對樣品不提純進行實時核磁檢測，利用1H-NMR 譜圖中各基團的化學位移及積分比例來確定聚合反應程度。圖3（a，b）分別為不同反應時間下HBPAE-250、HBPAE-575 的1H-NMR 譜圖，化學位移4.0～4.1 處為與酯基相連的亞甲基質子峰，4.1～4.3 處為與丙烯酸酯基相連的亞甲基質子峰，5.8～6.5 處為丙烯酸酯鍵上的雙鍵質子峰。隨著反應的進行，與丙烯酸酯基相連的亞甲基和雙鍵的質子峰積分面積逐漸減小，與普通酯基相連的亞甲基質子峰積分面積逐漸增加，通過核磁譜圖中積分面積的變化，可以計算聚合反應的程度。聚合反應程度與時間的關系如圖3（c，d）所示。由圖3（c，d）可見，兩種體系的聚合反應程度都隨著時間的增加而增加，HBPAE-250 體系在反應到24 h 時聚合反應程度達到99.0%，反應48 h 時達到100%；HBPAE-575 體系在反應到24 h 時，聚合反應程度僅為70%，反應48 h 時僅達到78%。

圖 3 不同時間下HBPAE 的1H-NMR 譜圖（a，b）和聚合反應程度（c，d）Fig. 3 1H-NMR spectra （a, b） and degree of polymerization （c,d） of HBPAE at different time

與HBPAE-250 相比，HBPAE-575 由于A2單體分子量的增大，鏈長度增大，導致分子鏈兩側的丙烯酸酯基團反應位阻增大，反應活性降低，聚合反應程度降低。因此，本文將反應體系溫度提高至80 ℃進行反應，并利用1H-NMR 監測反應的進行，結果匯總于表1。由表1 可見，當體系反應溫度為80 ℃，反應時間為48 h 時，HBPAE-575 體系聚合反應程度僅有80.0%，聚合反應程度提高不明顯。當繼續提高反應溫度至100 ℃時，聚合反應體系極易發生凝膠。

研究表明，合成表面含丙烯酸酯鍵、骨架含PEG、內部含叔胺的具有三維橢球狀結構的超支化聚酯胺的反應條件是：A2單體為Mn=250 的PEGDA，反應溫度為60 ℃，反應時間為24 h。

表 1 不同時間和溫度下的聚合反應程度Table 1 Degree of polymerization at different time and temperatures

2.2 HBPAE-250 的結構表征

超支化聚酯胺的化學結構如圖4 所示。HBPAE-250 提純后的1H-NMR 和FT-IR 譜圖如圖5 所示。HBPAE-250 的核磁共振氫譜圖中，化學位移2.5～3.0 處出現與N 相連亞甲基的質子峰，4.0～4.1 處出現與酯基相連的亞甲基的質子峰，4.1～4.3 處為與丙烯酸酯基相連的亞甲基質子峰，5.8～6.5 處為丙烯酸酯鍵上的雙鍵質子峰，其他質子峰的位置以及積分面積如圖5（a）所示。HBPAE-250 的紅外譜圖中，1 734 cm-1處出現了―C＝O 的伸縮振動峰，1 360 cm-1處出現了C―N 的伸縮振動峰。結果表明，超支化聚酯胺合成成功。

由于HBPAE-250 不能通過核磁共振氫譜計算其支化度，因此通過GPC-MALLS 對其拓撲結構進行表征，結果如圖6 所示。圖6 為HBPAE-250 的Mark-Houwink-Sakurada 曲線。測試得到Mark-Houwink 參數（α）為0.417，超支化聚合物的α 一般為0.2～0.5[22]，證明HBPAE-250 具有高度支化結構。

2.3 HBPAE-imidazole 的結構表征

圖 4 超支化聚酯胺的結構式Fig. 4 Chemical structure of hyperbranched poly(amino-ester)

圖 5 HBPAE-250 的1H-NMR（a）和紅外譜圖（b）Fig. 5 1H-NMR （a） and FT-IR （b） spectra of HBPAE-250

HBPAE-imidazole 的結構式、1H-NMR 圖譜、FT-IR 光譜和GPC 曲線如圖7 所示。HBPAE-imidazole 的1H-NMR 譜圖中，5.8～6.5 處丙烯酸酯鍵上的雙鍵質子峰消失，6.8～7.5 處出現咪唑上亞甲基的質子峰，其他質子峰的位置和積分面積如圖7（b）所示。HBPAEimidazole 的紅外譜圖中，1 360 cm-1處為C—N 的伸縮振動峰，其他基團特征峰如圖7（c）所示。通過HBPAE-imidazole 的GPC 曲線測得其Mw=1.42×103，Mn=1.36×103，PDI=1.05。結果證明HBPAE-imidazole已成功合成。

圖 6 HBPAE-250 的Mark-Houwink-Sakurada 曲線Fig. 6 Mark-Houwink-Sakurada curves of HBPAE-250

2.4 超支化聚酯胺的水溶性和pH 響應性

將HBPAE-250 和HBPAE-imidazole 分別溶解于pH 為7.4 和6.0 的PBS 緩沖液（20 mg/mL）中，溶液的數碼照片如圖8 所示。從圖8 可觀察到，在pH 為7.4 和6.0 的緩沖液中，HBPAE-250 和HBPAEimidazole 都呈淡黃色透明狀，表現出良好的水溶性。但是HBPAE-250 和HBPAE-imidazole 在pH 為7.4 的緩沖液中溶解時間略長，這是因為兩者內部均含大量叔胺，在酸性條件下，叔胺發生質子化，聚合物攜帶大量正電荷，從而導致聚合物的溶解更快。結果表明PEG 的引入賦予了超支化聚酯胺水溶性。

圖 7 HBPAE-imidazole 的結構式 （a），1H-NMR 譜圖 （b），FT-IR 譜圖 （c） 和GPC 曲線 （d）Fig. 7 Chemical structure （a）, 1H-NMR spectrum （b）, FT-IR spectrum （c） and GPC curve （d） of HBPAE-imidazole

圖 8 HBPAE-250 和HBPAE-imidazole 在不同pH 的PBS 緩沖液中的數碼照片Fig. 8 Photos of HBPAE-250 and HBPAE-imidazole in PBS buffer at different pH values

圖 9 不同pH 下HBPAE-250 和HBPAE-imidazole 的Zeta 電位Fig. 9 Zeta potential of HBPAE-250 and HBPAE-imidazole at different pH values

將HBPAE-imidazole 和HBPAE-250 分別溶于PBS 緩沖液（20 mg/mL）中進行Zeta 電位測試，結果如圖9 所示。兩種聚合物的Zeta 電位隨著pH 的增大而減小，這是因為HBPAE-250 和HBPAE-imidazole內部均含大量叔胺，在低pH 時，叔胺易發生質子化，使聚合物攜帶大量正電荷；而相同pH 下HBPAEimidazole 的Zeta 電位遠比HBPAE-250 的Zeta 電位高，這是因為HBPAE-imidazole 表面含有大量咪唑基團，叔胺數量遠高于HBPAE-250，導致叔胺質子化后，攜帶的正電荷數量更多。結果表明咪唑基團的引入大大提高了超支化聚酯胺的pH 響應性。

3 結 論

（1）合成表面含丙烯酸酯鍵、骨架含PEG、內部含叔胺的具有三維橢球狀結構的超支化聚酯胺的適宜條件：A2單體為Mn=250 的聚乙二醇二丙烯酸酯，反應溫度為60 ℃，反應時間為24 h。

（2）聚乙二醇的引入賦予了超支化聚酯胺水溶性。

（3）利用咪唑對骨架含PEG 的超支化聚酯胺進行功能化改性，提高了超支化聚酯胺的pH 響應性。