降解廢棄油脂的纖維素固定化脂肪酶模型的建立

佟妍 楊若茜 王沐青 李昭華 岳蕾

摘 要：選擇最佳纖維素固定化脂肪酶降解廢棄油脂，緩解生活中廚余廢水問題，作者以殼聚糖，羥丙基甲基纖維素和海藻酸鈉-羧甲基纖維素鈉為載體，研究偶聯法是啊和包埋法固定化脂肪酶，并通過試驗考察了不同載體固定脂肪酶固定化的效果。研究結果表明，包埋法固定化的脂肪酶的固定化效率高，但酶活回收率低，殼聚糖偶聯法最優，固定化脂肪酶固定化率35%，酶回收率達72.6%。

關鍵詞：殼聚糖;羥丙基甲基纖維素;海藻酸鈉;脂肪酶;固定化

1 研究背景

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3），三酰基甘油酰基水解酶，能在油一水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交換、多肽等有機合成反應，是目前被重點研究的酶催化劑。隨著研究的逐漸深入，脂肪酶因其催化效率高、清潔作用條件溫和等特性，被廣泛應用于污水處理、食品加工等領域，但游離脂肪酶存在易失活、不易回收、難重復使用等問題。而固定化酶可解決以上問題，與游離酶相比，固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應特性的同時，又呈現操作穩定性高、分離回收容易、可多次重復使用、操作連續可控和工藝簡便等優點。

隨著人們生活水平的提高，日趨嚴重的廚余垃圾油脂處理和分解問題亟待解決，固定化脂肪酶技術應用于環境保護引起了我們的關注。通過了解到該方面目前發展仍有一定的缺陷和不足，本研究希望通過固體材料利用物理吸附或化學結合的方式將脂肪酶富集于一定纖維素載體區域內，通過對比不同纖維素類載體，如羥丙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、殼聚糖，來研究它們的固定化的效果，研究不同作用條件下的區別，以脂肪酶的活性及回收率，選取最優條件下的方案，從而達到成本低，效率高，回收率高等效果，進而推及固定化脂肪酶應用于環境保護領域。

脂你版肪酶的固定因其可重復使用等優點近幾年轉變為酶工程重點研究對象，現已經提出物理吸附法、離子結合法、共價結合法、包埋法等多種方式，各有優劣，選擇的載體也各不相同，本文考慮到衣物內的主要交聯成分是纖維素，含量不穩定且已經過制衣廠一次加工，形態結構固定，難以參與脂肪酶固定反應。因此，將固定化載體選為更為本質、純度更高的纖維素，其中羥丙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、殼聚糖已有一定的酶固定化領域的基礎，且都價格低廉、無毒。通過本次研究希望能為解決日趨嚴重的廚余垃圾油脂污染問題奠定基基礎。

2 研究方法

2.1儀器

電子天平;溫控搖床;紫外分光光度計;離心機;單道移液器;恒溫搖床;加熱型磁力攪拌器;脫色搖床。

2.2材料

脂肪酶，SIGMA;牛血清蛋白，ExCell;殼聚糖，98%六亞甲基二胺水溶液，SIGMA-ALORICH;25%戊二醛水溶液，0.1M磷酸鈉緩沖液;羥丙基甲基纖維素，蒸餾水;無水氯化鈣，海藻酸鈉，2-丙醇溶劑，85%磷酸;95%乙醇，考馬斯亮藍試液，羧甲基纖維素鈉，4-硝基苯丁酸酯。

2.3步驟

2.3.1脂肪酶的固定化

2.3.1.1殼聚糖-脂肪酶固定

將殼聚糖（3.9g）與50mL的2%六亞甲基二胺水溶液在室溫下反應2小時[5]。 反應后，用離心機離心，取下層沉淀，用50mL5%戊二醛水溶液在室溫下處理1小時， 逐次洗滌該物質。將處理后的酶溶液加入活化的殼聚糖沉淀中，置于搖床中攪拌反應3小時，在4-5℃下深度冷凍儲存。

2.3.1.2羥丙基甲基纖維素-脂肪酶固定

將向盛有1.17g羥丙基甲基纖維素中加入100mL蒸餾水中，將所得溶液在搖床劇烈攪拌4-5小時充分溶解[2]。將處理后的酶液加入，得到的混合物在180rpm下攪拌60分鐘，得到羥丙基甲基纖維素固定酶基質。基質倒入培養皿中，約5mm厚度。在37℃的烘箱中干燥約18小時， 形成羥丙基甲基纖維素固定化脂肪酶的白色薄膜，培養皿置于4-5℃下深度冷凍儲存。

2.3.1.3羧甲基纖維素鈉（海藻酸鈉）-脂肪酶固定化

稱取1g的海藻酸鈉和0.25羧甲基纖維素鈉，用加熱磁力攪拌器100℃加熱溶解，冷卻后定容到100ml。用注射器將混合基質用針管逐滴加入0.1 mol/L CaCI2溶液中，固化30 min。最后，過濾并用蒸餾水洗凈固定化顆粒，濾紙吸干水分后將顆粒置于4-5℃下深度冷凍儲存。

2.3.2 固定率的計算

利用考馬斯亮藍法[4]測定蛋白質含量，并根據公式：固定率=固定化脂肪酶上蛋白質量/固定前游離酶液中蛋白含量，分別計算三種載體固定率。

2.3.3脂肪酶的活力測定[2]

利用分光光度計在405nm處測定三種固定化脂肪酶的吸光度，并采取公式：U=[△A/（0.01×t）]×D計算三種固定化脂肪酶的活力，其中U為酶活力;△A是反應時間內吸光值的變化;t為反應時間（min）;D為稀釋倍數。

3 研究結果

3.1脂肪酶的固定化

羧甲基纖維素鈉（海藻酸鈉）-脂肪酶固定化凝膠顆為直徑為2mm的淡黃色透明膠狀小球，不溶于水（圖1a）;殼聚糖-脂肪酶固定化凝膠呈橙黃色固體（圖1b），不易溶于水，無特殊氣味;羥丙基甲基纖維素-脂肪酶固定化凝膠呈淡黃色薄膜（圖1c）。

圖1三種脂肪酶固化物

3.2考馬斯亮藍測定蛋白含量計算固定效率

數據及計算結果如表1。

3.3固定化脂肪酶的活力

3.4固定化殼聚糖-脂肪酶填充柱

根據固定率和回收率的測定結果，殼聚糖固定化是實驗三種載體中的最優材料，故選擇殼聚糖固定化脂肪酶作為填充物質來設計脂肪酶填充柱用于家庭廚余廢水處理（圖3）。

4結果分析

4.1殼聚糖固定化脂肪酶回收率最高

殼聚糖固定化脂肪酶在固定時形成作用力較強的化學共價鍵，不易受到外界因素干擾而斷裂，回收率高，約為0.726。且共價鍵不在酶的活性中心，不影響脂肪酶的作用效果。脂肪酶結合在殼聚糖表面，易與底物充分反應，活力可高達1.95，作用效果好。而羧甲基纖維素鈉和羥丙基纖維素固定化脂肪酶是作用力較弱的物理結合，易遭到外力破壞，難以回收。羧甲基纖維素鈉固定脂肪酶形成囊狀結構，而羥丙基纖維素固定脂肪酶形成固態薄膜，脂肪酶包被在載體內部，阻礙其與底物反應，作用效果不佳。

4.2羧甲基纖維素鈉和羥丙基纖維素固定化脂肪酶的固定率高于殼聚糖

長鏈的海藻酸鈉分子在鈣離子的交聯作用下聚在一起，形成不溶于水的凝膠球，將水中作為溶質的脂肪酶被完全包起來，使上清液中幾乎無游離脂肪酶，因此固定率高。

羥丙基纖維素固定化脂肪酶同樣是膠狀物質，脫水后形成硬膜使酶被封存，原游離酶溶液中的酶分子都被限制在薄膜內部，僅有水分子以蒸發的形式散出，體現出羥丙基纖維素作為載體固定率高。

殼聚糖的固定率較低，約為0.35。殼聚糖與六亞甲基二胺反應，得到大量羥基和氨基，促進其以共價方式將酶固定于其氨基或羥基上，但反應時間不足，液體中殘留了游離酶。且反應受外界條件和自身的限制，共價鍵結合的殼聚糖無法脫離液相，也造成殼聚糖固定率低。

4.3固定化殼聚糖-脂肪酶填充柱適用于廚余污水處理

在脂肪酶參與反應方面，由于固定化殼聚糖脂肪酶呈固態且顆粒直徑較小，既延緩了水分子通過，讓酯類水解反應充分進行，保證了脂肪酶催化效果，同時也不會堵塞出口，使廚余水中的甘油三酯降解為甘油二酯、單甘油酯、甘油和脂肪酸，降低水環境污染，減輕污水處理廠的負擔。

裝置使用方面，流出液澄澈，不會污染水源。主要因為固定化酶的直徑剛好大于濾網，不會有顆粒物滲出，同時活化后的殼聚糖自身穩定，不易受環境影響而褪色。裝置類似層析柱，可接入家庭出水管道或是小范圍內出水總管道中，可大規模生產使用。

5 研究結論

羥丙基纖維素、羧甲基纖維素鈉作為載體的酶固定率略優于殼聚糖，但回收率低;殼聚糖固定化脂肪酶固定率為35%，回收率達72.6%，因此，固定化殼聚糖-脂肪酶填充柱有較好的實用性和推廣性。

參考文獻：

[1]楊桂蘭、郭學平，Lowry 法和 Bradford 法測定玻璃酸鈉中蛋白質含量的比較， 中國生化藥物雜志，2003年第24卷第3期.

[2]Fabr1′cio M. Gomes， Ernandes B. Pereira， and Heizir F. de Castro，Immobilization of Lipase on Chitin and Its Use，Biomacromolecules， Vol. 5， No. 1， 2004.

[3]虞鳳惠、馬韻升等，海藻酸鈉與羧甲基纖維素鈉固定化高溫堿性脂肪酶，中國釀造，2015年第34卷第5期.