熔融沉積技術增量制造不同孔隙率聚醚醚酮材料的骨相容性實驗研究

黃嘉蕊 鐘業宏 俞哲元 韋敏

聚醚醚酮(Polyetheretherketone，PEEK)是一種半結晶化合物，通過雙酚類化合物的逐步二烷基化反應生成。PEEK是一種高耐熱的熱塑性材料，其抗拉強度及彈性模量幾乎接近人類骨骼，是優良的骨植入物[1]。

顱面骨組織缺損的修補與形態重建，是顱頜面外科極具挑戰的難題。目前，臨床常使用鈦網對顱面骨缺損進行修補，但長期隨訪發現，存在鈦板外露、不明原因癲癇發生等并發癥；此外，鈦網與組織間產生較高的剪切力，以及影像學下產生金屬偽影等問題，均限制了鈦金屬移植物的應用[2-3]。部分工程聚合物材料已被證明能夠很好地匹配人體骨骼的機械性能，具有降低應力屏蔽和骨丟失的潛力，有助于改善患者預后。PEEK材料是目前較常使用的工程聚合物材料，與鈦合金相比，具有過敏性低、無離子泄露、可影像學透視、可行三維定制打印等優點。雖然該材料的脆性較低，但因顱面部移植物對材料脆性要求不高，故PEEK材料仍有望成為顱面硬組織的替代物。

PEEK植入物的惰性疏水表面會導致纖維包裹并阻礙骨附著，導致在體內的骨整合性能及骨誘導能力方面存在重大缺陷。為提高PEEK的組織相容性，可通過表面涂層、化學物質混合、經化學處理等方式豐富PEEK表微結構。經處理的PEEK雖然提高了組織相容性[4-6]，但往往會出現其他的潛在問題，如經過磺化處理的PEEK留有腐蝕性、表面孔徑大小不一，HA-PEEK放置體內一段時間后涂層剝落等[7-8]。

熔融沉積技術(FDM)是將加工成絲狀的熱熔性材料(PEEK、PLA、蠟等)經過送絲結構送進熱熔噴嘴，在噴嘴內絲狀材料被加熱熔融，同時噴頭沿零件層片輪廓和填充軌跡運動，并將熔融的材料擠出，使其沉積在指定的位置后凝固成型，經層層堆積后形成產品模型的打印技術。本研究不采用化學處理方法，僅用FDM技術3D打印，直接對材料表面進行微孔化處理，避免了化學處理導致的不良效果，并檢測3D打印不同孔隙率PEEK材料對成骨細胞成骨活性的影響，從而為PEEK材料3D打印增材制造方法在臨床上的進一步應用提供基礎依據[9]。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

PEEK顆粒(Victrex，英國)，α-MEM培養基(Biological industries，以色列)，胎牛血清、胰蛋白酶、三抗(Gibco，美國)，AKP堿性磷酸酶定量檢測(Beyotime，中國)，0.2%茜素紅染色液(Solarbio，中國)，4%多聚甲醛(賽戈，中國)，10%氯化十六烷基吡啶(Sigma，美國)，10%磷酸緩沖液(HyClone，美國)，成骨誘導培養液(Cyagen，美國)，Triton-X100(Sigma-Aldrich，美國)。

FDM打印機(牛魔王3，三的部落科技股份有限公司，中國)，場發射掃描電子顯微鏡(Philips，荷蘭)；高溫消毒柜(ldzm-40kcs，上海茸研儀器有限公司)；倒置顯微鏡(Nikon，日本)。

1.2 多孔隙材料的制備

以三維CAD模型數據為基礎，通過FDM技術以35 mm/s的速度、420 ℃、直徑0.4 mm噴頭，以逐層疊加的方式打印出直徑13 mm、高度3 mm的圓柱形PEEK材料，孔隙率分別為40%、50%、60%，以實心PEEK材料為對照組(圖1)。

從左往右：40%、50%、60%孔隙率PEEK及實心PEEKFrom left to right: 40%, 50%, 60% porosity PEEK and solid PEEK

1.3 SEM電鏡檢測

以場發射掃描電子顯微鏡對所獲取的樣品進行掃描，獲取樣品表面微觀形貌，觀察樣品表面的多孔結構。

1.4 PEEK材料表面多孔化處理對細胞成骨活性的影響

1.4.1PEEK材料預處理

將4組不同孔隙率(40%、50%、60%及實心)的PEEK材料放置于高溫消毒柜里消毒風干，取出后置培養皿中，用10%PBS沖洗濕潤2～3遍。

1.4.2細胞的接種和生長

各組PEEK材料分別置于24孔板中，將培養于混有1%三抗、16.7%胎牛血清的α-MEM培養液里的MC3T3-E1細胞，調整細胞密度為4×105cells/cm2，取1 mL接種于材料孔中及無材料的空白孔中，無材料空白孔為空白對照組。接種24 h后首次換液，37 ℃、5% CO2保溫箱內培養3 d，第4天更換為成骨誘導培養液。

1.4.3細胞黏附和增殖情況

成骨誘導期間，倒置相差顯微鏡連續觀察細胞黏附生長情況，觀察細胞在不同時間段的形態學變化。

1.4.4MC3T3-E1細胞的骨向誘導

成骨誘導培養液每3天全量換液。分別在第7、14天進行堿性磷酸酶(AKP)活性檢測；第14、28天進行茜素紅定量檢測。

1.4.4.1AKP活性檢測

成骨誘導第7、14天抽棄培養液，用10% PBS清洗2遍，每孔加入500 μL裂解液(含0.05% Triton-X100的PBS)，置于37 ℃搖床30 min。按照AKP活性檢測盒說明書檢測裂解液中的AKP活性，波長405 nm下測定吸光度值。

1.4.4.2骨鈣素定量檢測

成骨誘導第14、28天時，各組樣本甲醛固定20 min，10% PBS溶液清洗2遍，茜素紅染色15 min， 10% PBS清洗2遍，各孔中加入10%氯化十六烷基吡啶(Cetylpyridinium chloride，Cpc)500 μL溶解鈣結節，置于37 ℃、5% CO2保溫箱15 min，所得溶液在波長570 nm下測定吸光度值。

1.4.5SEM電鏡檢測

成骨誘導第7、14、28天行SEM電鏡觀察，記錄細胞的黏附生長情況。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 細胞黏附增殖情況

PEEK材料與MC3T3-E1細胞共培養24 h后，大部分細胞貼于PEEK材料上生長，亦有少量細胞零星散落于材料孔隙中。成骨誘導第7天，細胞體積開始增大，細胞生長情況良好，在材料孔隙中呈梭形或多角形；成骨誘導第14天，可見孔隙間成骨細胞更大程度地匯合，有的成簇生長，中心密集，外層逐漸稀疏，有的在孔隙間形成漩渦狀；成骨誘導第28天，可見細胞數量明顯增加，匯合堆疊成團，有的長滿材料孔隙。成骨細胞在不同孔隙率材料上沒有特定的生長形態(圖2)。

2.2 SEM電鏡檢測

a: 60%孔隙率PEEK/MC3T3-E1成骨誘導第7天(4×)；b：40%孔隙率PEEK/MC3T3-E1成骨誘導第10天(20×)；c：40%孔隙率PEEK/MC3T3-E1成骨誘導第14天(4×)；d：60%孔隙率PEEK/MC3T3-E1成骨誘導第28天(10×)a: 60% porosity PEEK/MC3T3-E1 on the 7th day of osteogenesis (4×); b: 40% porosity PEEK/MC3T3-E1 on the 10th day of osteogenesis (20×);c: 40% porosity PEEK/MC3T3-E1 on the 14th day of osteogenesis (4×);d: 60% porosity PEEK/MC3T3-E1 on the 28th day of osteogenesis (10×)

SEM電鏡檢測可見PEEK材料上噴頭(直徑400 μm)擠壓堆疊出的條索紋路，PEEK材料基本光滑，偶見多余拉絲結構、孔徑堵塞現象，應為生產工藝不穩定所致。盡管使用同一個噴頭打印材料，但由于打印過程中漿料黏度、供料壓力及出絲速度等工藝參數的綜合影響，使不同孔隙率的整體多孔材料橫梁寬度會有誤差。SEM電鏡下測量40%、50%、60%孔隙率及實心PEEK材料的橫梁寬度分別為：(397±33)μm、(370±16)μm、(330±0)μm和(347±5)μm；孔隙寬度分別為：(273±40)μm、(357±21)μm、(573±21)μm。40%孔隙率PEEK材料最容易出現孔徑堵塞現象；50%孔隙率PEEK材料的孔隙寬度與實驗理想值(350 μm)最接近；60%孔隙率PEEK材料的橫梁寬度及孔隙寬度相對比較穩定，有較清晰的微孔結構(圖3)。

a：40%孔隙率；b：50%孔隙率；c：60%孔隙率；d：實心材料a: 40% porosity; b: 50% porosity; c: 60% porosity; d: solid PEEK

2.3 AKP活性檢測

分別于成骨誘導第7天、14天，對在不同孔隙率PEEK材料上培養的MC3T3細胞的AKP活性進行檢測，結果顯示：①成骨誘導第7天，4種不同孔隙率的PEEK材料對MC3T3細胞成骨活性有影響(P<0.05)，其中在40%、50%、60%孔隙率PEEK材料上培養的MC3T3-E1細胞的成骨活性相比空白對照組均明顯升高(P<0.05)，其中40%孔隙率PEEK材料上的成骨活性最高(P<0.05)。②成骨誘導第14天，4種不同孔隙率PEEK材料對MC3T3細胞成骨活性有影響(P<0.05)，在4種不同孔隙率PEEK材料上培養的MC3T3-E1細胞的成骨活性均明顯高于空白對照組(P<0.05)，其中60%孔隙率PEEK材料上的成骨活性最高(P<0.05)。③在4種不同孔隙率PEEK材料上培養的MC3T3細胞的成骨活性均隨培養時間延長而升高(P<0.05)(圖4)。

圖4 AKP活性檢測。

2.4 骨鈣素定量檢測

分別于成骨誘導第14、28天對在不同孔隙率PEEK材料上培養的MC3T3細胞的骨鈣素定量檢測，結果顯示：①成骨誘導第14天，在4種不同孔隙率的PEEK材料上培養的MC3T3-E1細胞的骨鈣素含量不同(P<0.05)，其中在實心PEEK材料上培養的MC3T3-E1細胞的骨鈣素含量最高(P<0.05)。②成骨誘導第28天時，在40%孔隙率PEEK材料上培養的MC3T3-E1細胞的骨鈣素含量最高(P<0.05)。③在40%、50%、60%孔隙率PEEK材料上培養的MC3T3細胞的骨含量均隨培養時間延長而升高(P<0.05)(圖5)。

圖5 骨鈣素定量檢測

3 討論

理想狀態下，植入物的設計是為了更好地模擬其替換的生物組織，以提供結構穩定性并支持骨生長。PEEK材料具有耐高溫性、耐腐蝕性、機械特性、耐水解性等，但其生物惰性和疏水性嚴重，在人體內會被周圍的纖維組織包裹，形成纖維包囊，從而延緩、抑制植入材料與周圍骨組織的融合[10-11]。通過不同方法可豐富PEEK材料的表面微結構，能夠有效地增加材料與周圍骨組織間的融合，但仍存在缺陷和不足[12]。隨著制造工藝的進步，目前已突破了處理材料移植物的限制，提供了更大的選擇范圍。

目前，臨床使用的PEEK植入物都是通過注塑成型(減材)制造的方式，通過將粉末狀PEEK聚合物填入注塑機內，加熱使之變成黏流態，在一定壓力和速度下使熔體注入模型后冷卻而成。這種方法制造出來的PEEK材料，其表面光滑，具有足夠的強度、剛度，但無益于PEEK與骨組織的結合。本實驗通過熔融沉積(FDM)3D打印技術直接在制造材料的過程中進行微孔結構的處理(包括控制孔隙率、孔徑大小等)，既節約了制造成本且不改變材料的化學生物特性，同時又提高了PEEK材料與骨的整合。

骨生成在不同階段有不同活躍的代謝指標，透過檢測不同時期的骨生成指標可以檢測成骨細胞在該時期的成骨活性。骨性堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)由成骨細胞分泌，在成骨過程中水解成磷酸酯和焦磷酸鹽，有利于成骨過程，因其具有高特異性和靈敏性，在體外實驗中常作為成骨早期的指標；骨鈣素(Osteocalcin，OC)是由成熟成骨細胞、軟骨細胞合成和分泌的，是成骨分化晚期成骨細胞成熟的標志物，OC對骨礦化過程起正向作用[13]。一般而言，ALP值的高峰在成骨細胞成骨第14天，而OC值隨著成骨時間推移而增高，ALP及OC的表達可以反映骨形成的過程。本實驗中，成骨細胞成骨早期(第7天)的ALP活性隨著孔隙率的增高而下降，實心材料最低；但到成骨中期(第14天)，AKP活性卻隨著孔隙率的增高而上升，其中40%孔隙率PEEK材料中細胞的AKP活性最低，其次是實心材料中細胞的AKP活性。另外，成骨早期、中期空白對照組(純MC3T3-E1細胞)的AKP活性均為最低，雖然各孔中種植的細胞密度相同，但由于純MC3T3-E1細胞中沒有放置材料，導致可供細胞黏附的表面積減少，使得細胞數減少，最終導致AKP分泌量減少[14-15]。各組不同樣本成骨第14天的AKP活性均比第7天高。在成骨中后期MC3T3-E1礦化過程中OC含量隨著孔隙率的增高而下降，以實心材料中細胞的OC含量最低；而成骨誘導第28天各組樣本的OC值均比第14天的高。4組樣本(40%、50%、60%孔隙率PEEK和實心PEEK)間比較，材料孔隙率越低，MC3T3-E1細胞礦化時間越早，這可能是由于孔隙率越低所創造的缺氧條件誘導成骨細胞表達VEGF，加快成骨細胞分化過程所致[16-17]，到成骨中后期仍然以40%孔隙率樣本中細胞的OC含量最高，因此我們認為40%孔隙率PEEK材料的成骨細胞相容性最佳。隨著培養時間延長，各組AKP活性及OC含量均有上升，說明改變PEEK材料表面結構對MC3T3-E1細胞沒有明顯的毒性反應。

本實驗采用FDM增材制造(3D打印)PEEK材料表面的微孔結構，在不改變PEEK的化學結構及不添加化學物質的前提下進行表面微孔化處理，證實增加表面微孔的PEEK材料比實心PEEK材料有更好的生物相容性[18]。成骨細胞在4組不同樣本的PEEK表面黏附、鋪展，生長良好，表明微孔處理PEEK材料具有良好的體外成骨細胞相容性。

4 小結

本研究證實通過生產工藝改變PEEK微結構，包括孔隙率、孔隙直徑等可達到提高生物相容性的效果。通過增加PEEK材料的表面微孔結構，可達到提高體內材料-骨整合能力，有利于增加植入物的彈性、穩定性及使用壽命，PEEK有望成為更理想、應用更廣泛的新型骨替代材料。