改良的大鼠鼠尾增生性瘢痕動物模型制備方法

徐祥文 鄺依敏 黃昕 高雅姍 李海洲 顧舒晨 昝濤

增生性瘢痕的形成機制尚不清楚，僅通過研究臨床增生性瘢痕標本無法探究其發生發展中的病理改變。因此，建立可靠的動物模型是探究增生性瘢痕形成機制的必要步驟。目前應用較多的增生性瘢痕動物模型主要以兔耳增生性瘢痕模型[1]、免疫缺陷移植小鼠[2]、豬增生性瘢痕模型[3]、小鼠皮膚傷口牽張[4]與藥物誘導模型[5]等為主，但由于創面結構及免疫微環境的差異、增生性瘢痕外觀與模型建立的不穩定等因素，限制了動物模型的廣泛應用及增生性瘢痕的研究進展。

近期，Zhou等[6]提出通過在大鼠鼠尾建立矩形創面，并待其充分再上皮化后對鼠尾施加機械牽張力的方法來建立增生性瘢痕的動物模型。由于鼠尾結構中無肉膜結構，該模型創面愈合及瘢痕形成過程與人增生性瘢痕高度相似，且瘢痕的大體形態與組織學變化表現為瘢痕厚度的增加、膠原排列的紊亂及增生性瘢痕相關蛋白的上調。然而，在鼠尾的不同節段其肌肉與肌腱分布不同，導致彎曲所需的牽張力不同。因此，本文通過比較距鼠尾根部3 cm處與5 cm處的創面牽張力，分析不同張力牽張下的增生性瘢痕大體外觀與組織學特征改變，并通過張力相關蛋白的檢測明確鼠尾增生性瘢痕的建立與張力環境的關系，為該模型在增生性瘢痕研究中的應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與材料

6周齡雄性SD大鼠20只，體質量200～250 g(本院實驗動物中心提供)。根據創面距鼠尾根部的距離隨機分為A組(距尾端3 cm)和B組(距尾端5 cm)，每組10只。

Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，兔抗人α-SMA 單克隆一抗、兔抗人FAK單克隆一抗、P-FAK單克隆一抗、兔抗人YAP單克隆一抗(Abcam，USA)，DAB(Vector Laboratories，USA)。

1.2 實驗方法

大鼠腹腔麻醉后，使用亞甲藍在大鼠鼠尾相應位置(3 cm、5 cm)處標記6 mm的矩形創面，切開標記部位的全層皮膚。壓迫止血后采用無菌紗布包扎，2 d后拆除紗布(此時傷口無滲出)，16 d時待創面再上皮化后安裝鼠尾牽拉裝置。牽拉裝置為直徑2 cm的不銹鋼環，將鼠尾創面固定于不銹鋼環上進行牽拉(圖1)，并于牽拉28 d后切取瘢痕組織。取材組織一份采用4%多聚甲醛固定包埋，石蠟切片(5 μm厚)；另一份凍存，用于組織蛋白提取。

圖1 大鼠鼠尾創面建立位置及牽拉外觀

1.3 牽張力幅度變化測量

術后16 d創面再上皮化后安裝鼠尾牽拉裝置，并進行創面牽張前的縱向長度(L1)與創面牽張后的縱向長度(L2)的測量。牽張力幅度變化的計算公式如下：

1.4 大體觀察

于牽拉后7 d、14 d、21 d、28 d對大體瘢痕組織進行拍照，并利用ImageJ軟件(National Institutes of Health，Bethesda，USA)進行分析并測量瘢痕厚度。

1.5 組織學觀察與免疫組化

石蠟切片后行Masson染色，利用ImageJ軟件進行膠原體積分數(Collagen volume Fraction)測量。

按照免疫組化標準流程進行脫蠟與水化，并加入兔抗人α-SMA 單克隆一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜。加入山羊抗兔IgG-HRP室溫孵育1 h后，DAB顯色。

1.6 張力相關蛋白檢測

1.6.1Western blot

將凍存的一份瘢痕組織進行研磨后冰上裂解30 min，離心取上清后進行BCA法蛋白定量。等量蛋白經電泳后轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉固定后加入兔抗人FAK單克隆一抗、P-FAK單克隆一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。二抗室溫孵育1 h后行ECL顯影。利用ImageJ分析灰度值，比較蛋白表達量。

1.6.2免疫熒光法

將石蠟切片按照免疫熒光染色流程進行脫蠟、水化與破膜，并加入兔抗人YAP單克隆一抗(1∶200)，4 ℃孵育過夜。加入山羊抗兔IgG-HRP 室溫孵育1 h，DAPI染核后中性樹脂封片。熒光顯微鏡下觀察陽性細胞數目。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 創面所受牽張力變化

在大鼠鼠尾創面再上皮化后，使用外徑為2 cm的不銹鋼環進行牽張。A組、B組創面所受牽拉力分別增加了(22.78%±2.452%)和(15.46%±2.193%)，兩組具有統計學差異(P<0.05)(圖2)。

圖2 牽張力測量結果(*： P<0.05)

2.2 瘢痕大體外觀

牽拉7 d、14 d后，A組與B組大鼠鼠尾可見部分瘢痕色澤紅潤，質地較硬，然而兩組均未見明顯瘢痕厚度變化。牽拉28 d后，A組可見明顯的與人增生性瘢痕相似的組織外觀，且A組瘢痕隆起高度較B組增高了(51.97%±6.992%)，兩組瘢痕厚度差異顯著(P<0.05)(圖3)。

2.3 組織學Massoon染色、α-SMA蛋白表達比較

牽拉28 d后，兩組瘢痕組織均可見表皮網釘結構減少，皮膚附件和毛發消失。Masson染色可見A組膠原束粗大，且呈漩渦樣紊亂排列；B組也可見部分粗大膠原束，且隨張力牽張方向呈平行排列。兩組膠原體積分數分別為(37.34%±2.780%)和(25.18%±1.070%)，差異顯著(P<0.01)(圖4 A、4B)。

A：大體觀察；B：瘢痕厚度(*： P<0.05)A: General observation; B: Scar thickness (*: P<0.05)

免疫組化染色結果顯示，A組可見α-SMA蛋白在全層均高度表達，B組可見α-SMA蛋白主要在淺層真皮內高度表達，在深層真皮區表達較低。A組α-SMA表達較B組高(24.06%±3.675%)，兩組蛋白表達差異具有統計學意義(P<0.05)(圖4C、4D)。

2.4 張力相關蛋白表達差異

Western blot結果顯示， A組P-FAK/FAK表達較B組高(25.00%±2.447%)，兩者差異具有統計學意義(P<0.05)。免疫熒光結果顯示，大鼠鼠尾增生性瘢痕的YAP蛋白主要表達于真皮層中。B組YAP蛋白多數表達于細胞質中，少數激活的YAP蛋白表達于細胞核中；A組、B組的YAP蛋白細胞核內陽性表達率分別為(38.01%±2.101%)和(21.27%±2.684%)，A組激活的YAP蛋白在細胞核內的表達水平顯著高于B組(P<0.001)(圖5)。

3 討論

張力是形成增生性瘢痕的重要因素之一。在既往張力誘導的增生性瘢痕動物模型中，缺乏對不同張力影響模型建立的探討。大鼠鼠尾解剖與功能學的研究發現，鼠尾肌肉與肌腱極大地影響了鼠尾的彎曲與活動[7]，根據尾椎骨排序將鼠尾肌束分為4組(Co5～10、Co11～16、Co17～22、Co23～28)，其中Co5～10的鼠尾肌肉長度與重量均顯著高于其他組[8]，提示該段在鼠尾活動中提供較大的支持力以維持自身穩定不易彎曲。我們將A、B 兩組創面建立于不易彎曲的Co5～10，以保證兩組創面在位置、組織結構基本相同的情況下，比較不同外在牽張力對大鼠鼠尾增生性瘢痕形成的影響。

A：Masson染色結果；B：膠原體積分數；C：免疫組化α-SMA染色結果；D：α-SMA 陽性染色比例A: Results of Masson staining; B: Collagen volume fraction; C: Expression of α-SMA by immunohistochemical staining; D: Positive staining ratio of α-SMA

A：FAK 蛋白磷酸化及定量分析；B：YAP蛋白表達及細胞核內陽性表達比例A: Phosphorylation of FAK protein and the quantification of P-FAK/FAK; B: Expression of YAP protein and the quantification of nuclear localization of YAP

局部機械張力被認為是病理性瘢痕形成最重要的因素[9]。增生性瘢痕的好發部位一般為張力較大的區域，如前胸區、肩部等，也說明局部張力可能參與增生性瘢痕的形成[10]，通過減少創面張力可緩解增生性瘢痕的發展[11]。既往體內研究證實，創面愈合過程中承受張力越大，其纖維化程度越高[12]。體外研究中使用不同牽張力可引起正常成纖維細胞向增生性瘢痕成纖維細胞轉化，并且發現瘢痕相關蛋白的表達水平與牽張力大小呈反比[13]，提示合適的外在張力可能影響增生性瘢痕的形成。有關機械信號轉導的研究證實，張力引起的局部黏著斑激酶(Focal adhesion kinase，FAK)的活化以及轉錄共激活因子相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)核異位，與纖維化密切相關[14]。FAK是一種位于細胞質的酪氨酸激酶，接受外界張力信號的輸入與細胞內張力信號的輸出，其下游介導細胞的增殖與遷移功能，既往在惡性腫瘤的侵襲與轉移中廣泛報道[15]。而YAP是Hippo信號通路下游關鍵的細胞內張力信號轉導因子，通過細胞外基質張力的調控可促使YAP蛋白的活化與核異位，進而影響細胞的增殖與遷移[16]。

本研究通過計算牽張力，初步證實A組創面承受的牽張力幅度變化大于B 組，持續牽張28 d后發現A組瘢痕明顯高于B組，且A組膠原分泌較多、排列紊亂、α-SMA表達等均高于B組，提示A組增生性瘢痕更接近人增生性瘢痕。通過檢測兩組瘢痕中張力相關蛋白FAK磷酸化與YAP細胞核異位，推測A組增生性瘢痕形成與高張力環境密切相關。上述結果表明，在距鼠尾3 cm處的高牽張力可能更加適合大鼠鼠尾增生性瘢痕的形成。

綜上所述，我們初步證實了大鼠鼠尾距尾部3 cm處的張力較大，于該處建立創面進行牽拉可獲得更接近于人增生性瘢痕的動物模型，為增生性瘢痕的研究提供了良好的基礎。