miR-214-5p 靶向PAK4對缺血再灌注大鼠的心肌損傷和免疫反應的調節作用

楊曦艷， 關曉楠， 趙文淑△， 劉 杰， 趙 亮, 楊 迪

(1首都醫科大學附屬北京朝陽醫院心臟中心， 2北京市高血壓重點實驗室， 北京 100020)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是指缺血心肌血流恢復再灌注造成新陳代謝功能障礙以及加重心肌細胞的結構性損傷而導致細胞死亡以及梗死擴大[1]，是冠狀動脈旁路移植術再灌注治療、冠狀動脈溶栓以及經皮冠狀動脈介入治療過程中發生的并發癥[2]，加速了心腦血管疾病的發生率和死亡率。因此，如何有效減輕MIRI是一個亟待解決的問題。微小RNA(microRNA，miRNA)被認為是心血管疾病的關鍵調控因子，包括心肌梗死、心力衰竭、心肌肥厚和心律失常等等[3]。因此，miRNA可能是MIRI的有效治療靶點。已有研究表明miR-214缺乏可導致嚴重的MIRI，促進纖維化進程以及心肌細胞凋亡[4]，因此，miR-214有望成為有效治療MIRI的靶點。miR-214-5p是miR-214從5’端的臂加工而來，可靶向p21活化蛋白激酶4(p21-activated protein kinase 4, PAK4),而PAK4是一類保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過對下游底物的磷酸化來參與并調節細胞增殖、分化、細胞骨架重構以及細胞凋亡等眾多細胞重要過程[5]。本項工作應用大鼠MIRI模型，探討miR-214-5p 靶向PAK4對缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)大鼠心肌損傷和免疫反應的作用。

材 料 和 方 法

1 動物

36只體重為(200±10) g 的SPF 級健康雄性 SD 大鼠，購自北京市醫療器械檢驗所，許可證號：SYXK(京)2015-0005。實驗動物在溫度(24±2) ℃ 左右、濕度50% 左右，光照為12/12 h光-暗的動物飼養室飼養，在實驗前適應性喂養1周。

2 主要試劑

心肌細胞購自ATCC(編號：ATCC-0006)。miR-214-5p過表達腺病毒(Ad-miR-214-5p)和對照腺病毒(Ad-Scramble)購自上海吉凱基因化學技術有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒購自江萊生物科研試劑有限公司(貨號：TO1061);丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購自上海晨易生物科技有限公司(貨號：1306-06-5);大鼠心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I, cTnI)、肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase-MB,CK-MB)、肌紅蛋白(myoglobin,Mb)、白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)、IL-1β和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factr-α, TNF-α) ELISA試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司(貨號：ml003145、ml059533、ml003054、ml102828、ml003057和ml002859);二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒購自上海晶康生物工程有限公司(貨號：JLC-SJ2508-250T)。

3 主要方法

3.1分組、體內基因轉移及MIRI大鼠構建[6]將大鼠隨機分為假手術組(sham組)、模型組(I/R組)、腺病毒對照組(Ad-Scramble組)和miR-214-5p過表達組(Ad-miR-214-5p組)，每組9只；腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥麻醉大鼠，在左胸第4和第5肋骨切口，輕輕打開心包以暴露心臟。通過26號針頭分別將100 μL 的Ad-miR-214-5p(1×109PFU)、Ad Scramble(1×109PFU)或鹽水溶液注入對應各組大鼠左心室前壁6個不同的位點， 縫合胸腔，讓大鼠恢復。4 d后，將所有大鼠再次麻醉，重新打開胸腔，使用6-0絲線縫合左前部下行冠狀動脈(left anterior descending coronary artery, LAD)，將1.5 mm醫用乳膠管放置在結扎線和LAD之間。通過收緊乳膠管周圍的結扎誘導心肌缺血，在缺血30 min后，取出乳膠管以恢復冠狀動脈循環。在再灌注后12 h，獲得心臟和血液樣品用于進一步分析。假手術組除LAD未結扎之外，進行相同的程序。

3.2RT-qPCR檢測miR-214表達水平 用TRIzol法提取總RNA并試劑盒說明逆轉錄為cDNA，進行real-time PCR檢測。反應條件：94 ℃預變性30 s; 94 ℃變性10 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環。β-actin作為內參照，應用凝膠成像系統(Bio-Rad)攝影，Quantity One 軟件進行掃描分析，計算采用2-ΔΔCt法。miR-214的上游引物序列為 5’-TGCGGACAGCAGGCACAGAC-3’，下游引物序列為 5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；內參照U6的上游引物序列為 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA- 3’,下游引物序列為 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

3.3HE染色觀察心肌損傷 將組織用甲醛固定后，用乙醇梯度脫水，再用二甲苯透明，用石蠟包埋切片；接著，用二甲苯脫蠟，乙醇至水；然后用蘇木精水溶液染色、乙醇脫水、伊紅染色液染色；乙醇脫水、二甲苯透明，封片觀察。

3.4ELISA檢測心肌損傷標志物、炎癥因子及活性氧水平 將樣品加入各反應孔，37 ℃反應45 min。接著用洗滌液洗滌 4 次，再加入生物素標記的抗體，在 37 ℃孵育30 min。洗滌后加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的鏈霉親和素混合均勻， 在37 ℃反應 30 min，接著加入顯色劑避光顯色，最后加終止液終止反應，檢測結果。

3.5氧化應激的檢測 將心肌組織在冰上研磨制成 10% 組織勻漿裝于離心管，離心取上清液。用考馬斯亮藍法檢測上清液中蛋白質含量，再按試劑盒使用說明操作進行SOD和MDA的測定。

3.6流式細胞術檢測細胞凋亡 加入適量胰酶細胞消化液消化細胞，離心棄上清，收集細胞，加入195 μL膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)結合液輕輕重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。200×g離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，進行流式細胞儀檢測。

3.7靶基因預測 應用基因預測軟件TargetScan (http://www.targetscan.org)預測miR-214-5p的靶基因。

3.8雙螢光素酶報告基因實驗檢測靶向關系 收集生長至對數期的心肌細胞，鋪于96孔板，每孔約4(103個細胞，24 h后，分別轉染Ad-Scramble+PAK4 WT、Ad-Scramble+PAK4 MUT、Ad-miR-214-5p+PAK4 WT和Ad-miR-214-5p+PAK4 MUT，根據雙螢光素酶報告基因試劑盒說明進行測定，用螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性比值表示螢光素酶的相對活性。

3.9Western Blot檢測凋亡標志蛋白、PAK4、磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-Akt)和磷酸化的雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR)表達 用RIPA裂解液提取培養3 d的各組大鼠心肌細胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，10% SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉膜儀轉移蛋白質至聚偏氟乙烯膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入對應的I抗于4℃封閉過夜，第2天加入對應II抗室溫封閉1 h，最后用增強型化學發光法曝光。

4 統計學處理

用統計軟件SPSS 21.0分析實驗數據，數據以均數±標準差(mean±SD)表示。均數之間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 MIRI誘導心肌細胞中miR-214表達下調

再灌注12 h后， MIRI大鼠心肌細胞中miR-214表達較無損傷假手術組顯著下調(P<0.01);與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠心肌細胞中miR-214表達無明顯變化，Ad-miR-214-5p組大鼠心肌細胞中miR-214表達顯著上調(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The expression level of miR-214 in myocardial cells was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖1 RT-qPCR檢測各組細胞中miR-214的表達水平

2 miR-214-5p過表達減輕 MIRI引起的心肌組織損傷

Sham組大鼠心肌組織結構致密整齊，心肌纖維完整，無心肌纖維斷裂；I/R組與Ad-Scramble組大鼠心肌組織出現細胞排列嚴重紊亂，大量心肌纖維斷裂，細胞變性壞死嚴重；Ad-miR-214-5p組大鼠心肌組織出現細胞排列輕度紊亂，較少心肌纖維斷裂，細胞變性壞死較輕，見圖2A。與sham組相比，I/R組大鼠CK-MB、Mb和cTnI表達顯著上調(P<0.01)；與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠CK-MB、Mb和cTnI表達無顯著變化，Ad-miR-214-5p組大鼠CK-MB、Mb和cTnI表達顯著下調(P<0.01)，見圖2B。

3 miR-214-5p過表達減輕MIRI引起的心肌細胞凋亡

與sham組相比，I/R組大鼠心肌細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠心肌細胞凋亡率無顯著變化，Ad-miR-214-5p組大鼠心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.01),見圖3。

Figure 2.Myocardial injury in rats of each group. A: myocardial injury was observed by HE staining; B: myocardial injury marker protein expression was detected by ELISA. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖2 各組大鼠心肌損傷情況

Figure 3.Apoptosis detected by flow cytometry. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖3 通過流式細胞術檢測細胞凋亡情況

與sham組相比，I/R組大鼠Bcl-2表達顯著下調，Bax、caspase-3和caspase-9表達顯著上調(P<0.01)；與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9的表達無顯著變化，Ad-miR-214-5p組大鼠Bcl-2表達顯著上調,Bax、caspase-3和caspase-9表達顯著下調(P<0.01),見圖4。

4 miR-214-5p過表達減輕 MIRI引起的氧化應激

與sham組相比，I/R組大鼠SOD活性顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著增高(P<0.01)；與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠SOD活性和MDA含量無顯著變化，Ad-miR-214-5p組大鼠SOD活性顯著增高(P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.01),見圖5。

5 miR-214-5p過表達減輕 MIRI引起的炎癥反應

與sham組相比，I/R組大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α的含量顯著升高(P<0.01)；與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α的含量無顯著變化，Ad-miR-214-5p組大鼠IL-6和IL-1β和TNF-α的含量顯著降低(P<0.01),見圖6。

6 miR-214-5p靶向調節PAK4

通過基因軟件篩選出PAK4作為miR-214-5p 的靶基因，miR-214-5p與PAK4的3’-UTR存在結合位點,見圖7A。雙螢光素酶報告基因檢測實驗顯示，miR-214-5p高表達明顯抑制了含有野生型PAK4質粒的螢光素酶活性，但對突變型PAK4質粒的螢光素酶活性無影響(P<0.01)，見圖7B。通過Western I/R組大鼠PAK4表達顯著下調(Pblot檢測PAK4的表達水平可知：與sham組相比，<0.01)； 與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠PAK4的表達無顯著變化，Ad-miR-214-5p組大鼠PAK4表達顯著上調(P<0.01)，見圖7C。

Figure 4.The expression levels of caspase-9, caspase-3, Bax and Bcl-2 detected by Western blotting. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖4 Western blot檢測caspase-9、caspase-3、Bax和Bcl-2的表達水平

7 miR-214-5p過表達激活 MIRI大鼠PI13K/Akt/ mTOR通路

與sham組相比，I/R組大鼠p-Akt和p-mTOR表達顯著下調(P<0.01)；與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠p-Akt和p-mTOR的表達無顯著變化，Ad-miR-214-5p組大鼠p-Akt和p-mTOR表達顯著上調(P<0.01)，見圖8。

討 論

miRNA是一類小的非編碼RNA，通過轉錄或轉錄后調控靶基因的表達是在MIRI中起關鍵的調控作用，如miR-17-3p、miR-146b[5-7]等。已有研究表明miR-214缺乏可導致嚴重的MIRI，增加纖維化進程以及心肌細胞凋亡[8]，因此，預測作為從miR-214 5’端的臂加工而來的miR-214-5p過表達能夠改善MIRI，并對其機制進行相關研究。

心肌組織損傷程度是MIRI最直觀的衡量指標，而CK-MB、Mb和cTnI等是心肌梗死的輔助診斷指標。本實驗結果顯示，miR-214-5p過表達下調MIRI大鼠CK-MB、Mb和cTnI表達。而CK-MB、Mb和cTnI高表達意味著心肌受損程度的加深[9]，這提示miR-214-5p過表達減輕MIRI。本實驗結果還顯示，miR-214-5p過表達降低大鼠心肌細胞凋亡率，上調Bcl-2，下調Bax、caspase-3和caspase-9。Bcl-2具有抑制細胞凋亡的作用，而Bax是與Bcl-2同源的水溶性相關蛋白，具有促進細胞凋亡的作用，二者都屬于線粒體凋亡途徑的標志蛋白[10]。caspase-3和caspase-9是半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶，是廣泛運用的凋亡標志蛋白，而細胞凋亡途徑主要有胞外信號激活細胞內的凋亡酶激活因子激活caspase和通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase途徑[11]。因此，miR-214-5p過表達明顯抑制MIRI大鼠心肌細胞依賴線粒體的凋亡途徑。

Figure 5.Oxidative stress of cardiomyocytes in each group. A: SOD activity; B: MDA content. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖5 各組大鼠心肌細胞氧化應激情況

缺血時自由基的產生遠遠超出自身內源性抗氧化系統的清除能力，引起氧化應激反應[12]，而活性氧可以引起細胞的凋亡[13]，從而加劇心肌細胞的損傷程度。SOD和MDA是氧化應激的主要指標，已有研究表明MIRI會引起SOD活性降低,MDA含量增加[14]。本項檢測顯示miR-214-5p過表達升高MIRI大鼠的SOD活性,減少MDA含量，說明miR-214-5p過表達能減輕MIRI大鼠的氧化應激反應。同時，MIRI會引起炎癥反應，而炎癥反應會加重MIRI[15]。本實驗結果顯示miR-214-5p過表達顯著降低MIRI大鼠IL-6，IL-1β和TNF-α的含量，這與已有研究抑制炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的釋放可以減緩MIRI大鼠心肌細胞損傷結果相一致[16]，說明miR-214-5p過表達能夠抑制MIRI引起的炎癥反應。

Figure 6.The levels of inflammatory factors IL-6, IL-1β and TNF-α measured by ELISA. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖6 ELISA檢測炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的含量

Figure 7.miR-214-5p targeted PAK4 and upregulated its expression. A:PAK4was predicted by gene software as a target gene of miR-214-5p; B: targeting relationship was detected by luciferase assay; C: the expression level of PAK4 was detected by Western blotting. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖7 miR-214-5p靶向上調PAK4

Figure 8.The protein levels of p-Akt and p-mTOR detected by Western blot. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖8 Western blot檢測p-Akt和p-mTOR的表達水平

本項實驗通過基因預測軟件篩選出miR-214-5p與PAK4的3’-UTR存在結合位點，PAK4是miR-214-5p 的靶基因，且miR-214-5p靶向上調PAK4的表達。已有研究表明PAK4過表達上調p-Akt和p-mTOR表達，激活PI3K/Akt/mTOR通路[17]。而PI3K/Akt/mTOR通路是具有調節各種重要的細胞功能，如蛋白質合成、細胞增殖、細胞凋亡、存活等，其可通過影響下游多種效應分子的活化狀態，在細胞內發揮著抑制凋亡、促進增殖的關鍵作用[18]。本文通過研究顯示miR-214-5p過表達能夠明顯上調p-Akt和p-mTOR表達，激活PI3K/Akt/mTOR通路，這與已有研究MIRI會抑制PI3K/Akt/mTOR通路激活相一致[19]。

綜上所述，miR-214-5p過表達靶向PAK4減輕MIRI，并抑制心肌細胞凋亡、氧化應激反應和炎癥反應，同時激活PI3K/Akt/mTOR通路。本實驗為MIRI的靶向治療提供實驗參考數據，但其具體分子機制尚待深入研究。