CCN1在脂多糖誘導急性肺損傷中的表達調控和在炎癥反應中的作用*

董 年， 王蓓蓓▲， 宋晨劍， 陳俊杰， 陳成水△， 石 林

(1溫州醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科， 浙江 溫州 325000; 2復旦大學附屬中山醫院呼吸與危重癥醫學科， 上海 200000)

富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich protein 61，CYR61/CCN1)是即刻早期基因(immediate-early gene)編碼的一種分泌型基質蛋白[1]，屬于CCN家族成員之一，與胚肺發育中的氣管生成和上皮成熟相關[2]。近年來逐漸認識到CCN1作為一種分泌型基質蛋白不僅參與生理發育過程，而且作為即刻早期蛋白參與不同肺部疾病的發生發展與轉歸[3]。作為一種新近認識的炎癥調節因子，細菌毒素、缺血缺氧和機械牽拉等不同病理條件刺激皆可以調控CCN1的快速時相表達，異常表達的CCN1又能以自分泌或旁分泌的方式參與炎癥反應、損傷后修復等病理生理過程[4]。Dolinay等[5]報道，即刻表達的CCN1可作為機械通氣相關肺損傷的一種敏感性生物標志物，Perkowski等[6]同樣揭示了高氧相關肺損傷中存在即刻表達的CCN1，然而目前關于CCN1在急性肺損傷中的表達調控機制和多效性的生物功能仍亟待闡明。本研究擬在觀察CCN1在正常肺組織中的表達定位和在脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)誘導肺損傷小鼠肺組織中表達變化的基礎上，探討LPS調控CCN1表達的分子機制和CCN1在LPS誘導炎癥介質表達中的作用，以CCN1為切入點深入揭示急性肺損傷的發病機制和尋找潛在的診治靶點。

材 料 和 方 法

1 材料和儀器

6～8周20 g左右SPF級雄性C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術公司，動物合格證號為SCXK(京)2016-0011。氣道上皮細胞16HBE購自上海中科院細胞庫。RPMI-1640培養液和胎牛血清購自Gibco；ERK1/2抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125、P38抑制劑SB202190和PI3K抑制劑LY294002購自Sigma；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、預染蛋白Marker和ECL 發光液購自Thermo；抗CCN1和GAPDH抗體購自Santa Cruz；重組CCN1蛋白購自PeproTech；cDNA逆轉錄試劑盒購自TaKaRa；TRIzol購自Invitrogen;CCN1-siRNA購自上海吉瑪公司。RT-qPCR引物由上海生工生物工程公司設計合成，見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2 實驗方法

2.1動物模型復制 選取6～8周20 g左右SPF級雄性C57BL/6小鼠，麻醉后以靜脈留置針經口氣管插管，接1 mL針筒后以水柱隨呼吸上下浮動作為插管成功標志。將LPS溶解于生理鹽水中，造模組根據4 mg/kg的劑量給予LPS氣道滴入，空白組給予等量的生理鹽水氣道滴入，造模成功4 h后麻醉處理動物獲取肺組織。

2.2免疫組化染色 處死動物后獲取肺臟組織石蠟切片，常規使用二甲苯脫蠟，雙氧水處理去除內源性過氧化物酶，檸檬酸抗原組織抗原修復液處理切片修復抗原。常規血清封閉， I 抗4 ℃孵育過夜、II 抗室溫孵育60 min，PBS清洗后使用DAB顯色，以PBS代替 I 抗作為空白對照，中性樹脂封片后顯微鏡進行攝片。

2.3免疫熒光染色 獲取生長狀況良好的對數生長期的16HBE細胞，玻璃爬片事先置于24孔板，24孔板每孔接種5×104個細胞，待次日細胞貼壁后4%多聚甲醛固定15 min，0.1% GEPAL穿孔破膜10 min，1% BSA封閉1 h，I抗4 ℃孵育過夜，II抗室溫孵育0.5 h，DAPI染核5 min，封片激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.4RT-qPCR 獲取生長狀況良好的對數生長期的16HBE細胞，按照TRIzol說明書提取細胞總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。取總RNA 2 μg反轉錄為cDNA，再以適量cDNA為模板進行real-time PCR。PCR條件為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40個循環。結果以GAPDH為內參照，針對目的基因進行相對定量。

2.5Western blot實驗 獲取生長狀況良好的對數生長期的16HBE細胞，細胞裂解液RIPA裂解細胞提取蛋白，使用BCA測定蛋白濃度。獲取取蛋白樣品30 μg蛋白至SDS-PAGE，濕轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h， I 抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min，II抗室溫孵育1.5 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，ECL化學發光法顯影，凝膠成像系統攝像分析條帶灰度值。

2.6siRNA轉染 獲取生長狀況良好的對數生長期的16HBE細胞,計數4×105個16HBE細胞接種于6孔板，每孔添加2 mL無抗生素的1640培養基，根據每孔8 μL的劑量獲取siRNA/每孔4 μL的劑量獲取Lipofectamine 2000分別添加入200 μL Opti-MEMⅠreduced serum medium比例稀釋，將siRNA-Lipofectamine 2000混合后室溫靜置20 min，然后添加入每孔，6 h后轉換為含血清RPMI-1640培養基進行后續實驗。實驗中涉及的siRNA序列見表1。

3 統計學處理

使用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析。數據均以均數±標準差(mean±SD)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異存在統計學意義。

結 果

1 CCN1在氣道上皮中的定位與表達

為探討CCN1的組織定位情況，獲取正常C57BL/6小鼠肺組織進行免疫組化染色，發現CCN1主要表達于小鼠氣道上皮細胞，見圖1A。同時對16HBE細胞進行CCN1免疫熒光染色也發現，氣道上皮16HBE細胞可明顯表達CCN1，且主要定位于胞漿，見圖1B。

Figure 1.The location and expression of CCN1 in the bronchial epithelium. A: the location and expression of CCN1 in bronchial epithelial cells from normal lung tissue of mice detected by immunohistochemical (IHC) staining; B: immunofluoescence analysis of CCN1 in bronchial epithelial cells.

圖1 CCN1在氣道上皮中的定位與表達

2 LPS誘導氣道上皮CCN1的表達升高

使用LPS氣道滴入構建C57BL/6小鼠急性肺損傷體內模型，獲取造模組肺組織后進行CCN1免疫組化染色，發現造模組氣道上皮CCN1的表達強度相對于正常對照組升高，見圖2A。使用LPS刺激16HBE細胞，分別利用RT-qPCR和Western blot對細胞中CCN1的mRNA和蛋白表達水平進行檢測，結果發現CCN1表達水平呈LPS刺激濃度依賴性升高，其中以1 mg/L濃度刺激最為明顯(P<0.05)，見圖2B、C。

Figure 2.LPS up-regulated the expression of CCN1 in the bronchial epithelial cells. A: the expression of CCN1 in the lung tissues of the mice exposed to LPS was measured by immunohistochemical staining; B: the mRNA expression of CCN1 was measured by RT-qPCR; C: the protein expression of CCN1 was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group.

圖2 LPS誘導氣道上皮CCN1的表達升高

3 ERK1/2、JNK、P38和PI3K信號傳導途徑參與LPS誘導的CCN1表達

分別使用不同濃度的P38、JNK、ERK1/2和PI3K信號通路特異性抑制劑預處理16HBE細胞2 h，然后加入LPS共培養4 h，通過Western blot檢測CCN1的表達，發現不同濃度的ERK1/2、JNK、P38和PI3K抑制劑均可以部分逆轉LPS誘導的CCN1表達升高，并呈一定的抑制劑濃度依賴性(P<0.05或P<0.01)，見圖3。

4 CCN1參與LPS誘導的炎癥介質IL-6、IL-8、TGF-β和VEGF的mRNA合成

使用重組CCN1蛋白刺激16HBE細胞，RT-qPCR檢測炎癥介質IL-6、IL-8、TGF-β和VEGF的mRNA水平，發現重組CCN1蛋白可以促進炎癥介質IL-6、IL-8、TGF-β和VEGF的mRNA表達水平升高，其中IL-6和IL-8在1 h、TGF-β和VEGF在0.5 h升高最為明顯(P<0.05)，見圖4A～D。使用siRNA轉染16HBE細胞后，RT-qPCR檢測CCN1的mRNA表達，發現相較于scrambled siRNA組，CCN1-siRNA可以顯著降低16HBE細胞CCN1的mRNA表達(P<0.05)，見圖4E。使用LPS刺激siRNA干預的16HBE細胞，發現CCN1-siRNA組IL-6、TGF-β和VEGF的mRNA升高幅度相對于scrambled siRNA組明顯降低(P<0.05)，而IL-8的差異沒有統計學顯著性，見圖4F。

討 論

炎癥瀑布反應是肺損傷發病的核心環節，涉及免疫細胞/結構細胞、促炎介質/抗炎介質的細胞-介質網絡失衡，尋找炎癥瀑布中的關鍵介質是診治的關鍵所在[7]。本研究聚焦即刻早期蛋白CCN1的表達定位和表達調控，與Moon等[8]報道相似，本研究通過免疫組化染色進一步揭示了CCN1在正常肺組織中以氣道上皮細胞表達為主，免疫熒光染色同樣發現CCN1作為分泌型基質蛋白主要定位胞漿，據此推測生理表達水平的CCN1具有維持氣道上皮正常生理功能的必要性。固有結構細胞氣道上皮細胞在損傷狀況下可以扮演啟動細胞的角色，即經分泌炎癥介質起始擴大初始的炎癥反應[9]。針對肺損傷時肺組織的免疫組化染色發現造模組氣道上皮CCN1的表達強度相較正常組明顯升高，考慮到研究使用的是氣道滴注LPS制造肺損傷模型，LPS率先作用氣道上皮促發氣道局部炎癥，據此推測氣道上皮即刻表達的CCN1可能在氣道局部炎癥和失控的炎癥瀑布轉化中發揮了重要的調控角色。基于以上肺損傷時氣道上皮即刻表達的CCN1實驗結果，后續的實驗圍繞氣道上皮來源CCN1的表達調控和炎癥反應。為了驗證以上體內實驗結果，使用LPS體外刺激氣道上皮細胞，發現CCN1的mRNA和蛋白表達升高。越來越多的研究表明CCN1作為即刻早期蛋白其表達廣泛接受細菌毒素、炎癥介質等的調控，其中調控機制涉及活性氧簇、內質網應激和P38 MAPK信號傳導通路等[10-11]。綜合我們之前在MAPK和PI3K信號通路在炎癥反應中的作用積累了豐富的經驗[12]，以及MAPK和PI3K信號傳導通路是LPS與TLR4配體-受體結合后常見的信號傳導通路[13-14]，利用特異性ERK1/2、JNK、P38和PI3K信號傳導途徑抑制劑預先處理，發現ERK1/2、JNK、P38和PI3K信號傳導通路參與介導LPS誘導的CCN1表達。考慮到在疾病狀態下CCN1的即刻表達特性，CCN1可能類似于應激蛋白，其表達接受廣泛性的調控[15]。

Figure 3.The roles of ERK1/2, JNK, P38 and PI3K signaling pathways in CCN1 up-regulation. A: bronchial epithelial 16HBE cells were pretreated with ERK1/2 inhibitor PD98059 (PD) for 2 h before LPS stimulation for 4 h; B: the 16HBE cells were pretreated with JNK inhibitor SP600125 (SP) for 2 h before LPS stimulation; C: the 16HBE cells were pretreated with P38 inhibitor SB202190 (SB) for 2 h before LPS stimulation; D: the 16HBE cells were pretreated with PI3K inhibitor LY294002 (LY) for 2 h before LPS stimulation. The CCN1 expression was measured by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group;+P<0.05,++P<0.01vsLPS group.

圖3 ERK1/2、JNK、P38和PI3K信號傳導途徑參與LPS誘導CCN1的表達

目前針對CCN1在肺損傷中多效性的功能仍待深入明確。張燕等[16]研究報道在機械通氣相關肺損傷中，異常表達的CCN1可以誘導肺泡上皮細胞的過早凋亡，然而有研究報道在高氧相關性肺損傷中，過高表達的CCN1可以逆轉肺泡上皮細胞的壞死[17]。之前的綜述總結CCN1是一個多效性炎癥介質，其多效性具有微環境調控性、組織細胞特異性[18]。本研究擬探討氣道上皮分泌的CCN1在氣道上皮炎癥反應中的作用，氣道上皮分泌的CCN1可以自分泌或旁分泌的方式發揮作用，利用重組CCN1蛋白刺激模擬CCN1的自分泌，發現CCN1刺激可以調控IL-6、IL-8、TGF-β和VEGF的表達，說明即刻表達的CCN1可以起始氣道炎癥反應的自我擴大過程。利用siRNA干擾技術，我們發現干擾CCN1的表達可以明顯降低氣道上皮細胞在LPS刺激下的炎癥反應程度，結合Moon等[19]研究報道CCN1的表達分泌可以擴大香煙提取物誘導IL-8的水平，說明CCN1是一個炎癥調節因子，在炎癥的起始和擴大中發揮了重要的調控作用。至于即刻表達的CCN1是如何參與調節LPS誘導的炎癥反應需要后續更加深入的研究。

Figure 4.The role of CCN1 in LPS-induced inflammatory response. Bronchial epithelial 16HBE cells were treated with recombinant CCN1 at 1 mg/L for different time. The mRNA expression of IL-6 (A), IL-8 (B), TGF-β (C) and VEGF (D) was mea-sured by RT-qPCR. E: the silencing efficiency of CCN1-siRNA; F: the mRNA expression of IL-6, IL-8, TGF-β and VEGF after transcription with scrambled siRNA or CCN1-siRNA upon stimulation with LPS for 4 h was measured by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsscrambled siRNA.

圖4 CCN1參與LPS誘導的炎癥介質IL-6、IL-8、TGF-β和VEGF的mRNA合成

本研究雖然初步揭示了氣道上皮來源的CCN1在表達調控和在炎癥反應中的作用，然而尚存著較多的不足之處。首先，研究圍繞著氣道上皮細胞進行，在研究層次上稍顯單一，不同來源的CCN1以及旁分泌的作用形式是后續的研究方向之一；其次，在研究深度上無論是使用特異性抑制劑或是siRNA干擾，說服力仍然欠缺，需要更多方位來說明CCN1的調控機制，目前已成功構建出氣道上皮條件性CCN1敲除動物模型[20]；最后，本研究僅僅選取了一個氣道上皮細胞16HBE，考慮到實驗的可靠性，以后勢必要在多種氣道上皮細胞系甚至在原代培養氣道上皮細胞中進行驗證。

總而言之，本研究初步探討了CCN1在氣道上皮的表達調控機制，闡明了CCN1是一個炎癥調節因子參與氣道上皮的炎癥反應，以CCN1為切入點揭示了急性肺損傷新的發病機制和未來潛在的診治靶點。