組蛋白H3K36me3與缺血再灌注誘導小鼠急性腎損傷的相關性研究*

徐衛衛， 伍聰聰， 王笑笑， 簡久瑩， 楊又璇， 張 妮， 郭 兵， 劉麗榮△

(1貴州醫科大學醫學檢驗學院臨床血液學教研室， 貴州 貴陽 550004； 2貴陽市第一人民醫院輸血科， 3貴州醫科大學貴州省常見慢性疾病發病機制及藥物研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是臨床上危重癥常見的嚴重并發癥，發生率和死亡率均較高，并有逐年增高趨勢[1-2]。AKI由多種病因造成，其中缺血再灌注(ischemia/reperfusion，IR)引起AKI是臨床上最常見的發病原因之一[3]。盡管經過多年研究，目前對IR引起的AKI仍缺乏有效的預防和治療措施。因此，進一步研究IR誘導AKI的發病機制及有效的治療措施至關重要。

據文獻報道，表觀遺傳學參與了腎臟疾病的發生與發展過程，在基因轉錄調控中起重要作用[4-5]。組蛋白甲基化是目前研究較廣泛深入的表觀遺傳修飾方式之一，是指組蛋白在組蛋白甲基轉移酶的作用下發生甲基化修飾的過程，通過影響組蛋白與DNA的親和性來改變染色體空間結構及狀態，調控基因的表達[6]。組蛋白不同位點的甲基化由不同的甲基轉移酶催化完成[7],如組蛋白H3第36位賴氨酸(histone H3 lysine 36，H3K36)可由N-賴氨酸甲基轉移酶SMYD2(SET and MYND domain containing 2)催化發生三甲基化(H3K36me3)。在常染色體顯性多囊腎患者和小鼠的腎上皮細胞中，SMYD2催化組蛋白H3K36和多種信號蛋白甲基化參與了腎囊腫生成和細胞凋亡[8]。組蛋白甲基轉移酶Set2介導的H3K36me3在DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break，DSB)處富集，促進DSB修復,減輕組織或細胞損傷[9],但H3K36me3是否參與AKI的發生與發展目前尚無相關文獻報道。研究發現，多種表觀遺傳修飾參與了AKI的發生與發展[10]，故本研究通過觀察H3K36me3在IR誘導的AKI小鼠腎組織中的表達變化，分析其與腎組織SMYD2及腎損傷程度的相關性，旨在探討H3K36me3在IR-AKI中的作用及其可能機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實驗動物 健康雄性ICR小鼠，體重18～20 g，周齡8周，購買于斯貝福(北京)生物技術有限公司，許可證號為SCXK(京)2016-0002，適應性喂養1周，自由飲水、攝食。

1.2主要器械、儀器及試劑 雙垂直電泳儀(北京六一，DYCZ-24DN)；全波長酶標儀(BIO-RAD，V111584)；高速離心機(BECKMAN Allegra X-30R Centrifuge)；自動生化分析儀(Cobas, c702)；旋渦振蕩器(杭州米歐，MIX-28+)；光學顯微鏡(耐博，M-30D)。蛋白提取試劑盒(Solarbio，R0010)；BCA定量試劑盒(碧云天，P0010S)；免疫組化試劑盒(Bioss，SP-0023)；DAB顯色試劑盒(Bioss；C02-04001)。抗體：β-actin(Bioss，bs-0061R)；中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL；Boster，PB0641)；H3K36me3(Abcam，ab9050)；P53(Wanleibio，WL01919)；p-P53(Wanleibio，WL02504)；促凋亡因子Bax(Wanleibio，WL01637)；抗凋亡因子Bcl-2(Wanleibio，WL01556)；cleaved caspase-3(Santa，sc7272)；信號轉導和轉錄活化因子3(signal transducer and activator of transcripition 3，STAT3;Abcam，ab68153)；p-STAT3(Abcam，ab76315);c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK;Abcam，ab179461);p-JNK1/2/3 (Abcam，ab124956)。

2 方法

2.1IR誘導AKI小鼠模型的構建 將30只ICR小鼠隨機分為IR組和假手術(sham)組。術前禁食8 h，自由飲水。腹腔注射戊巴比妥鈉(65 mg/kg)麻醉，固定、備皮、消毒，沿腹中線左右各0.5 cm分別作縱行切口，暴露雙側腎臟鈍性剝離腎蒂。微動脈夾夾閉雙側腎蒂，1 min內可見腎臟由鮮紅色變為紫黑色。夾閉45 min后，松開微動脈夾恢復血流灌注，觀察腎臟顏色變為鮮紅色，縫合腹腔。sham組僅鈍性剝離腎蒂，其余與IR組做相同處理。

2.2標本收集 小鼠給予標準飼料喂養，自由飲水攝食24 h。乙醚麻醉后眼眥取血，分離血清檢測腎功能指標。開腹留取雙側腎臟，1/2腎臟置于4%多聚甲醛中固定，用于腎組織病理分析；其余1/2腎臟置于-80 ℃冰箱中儲存，用于提取總蛋白和后續檢測。

2.3生化方法檢測腎功能指標血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr) 將全血置于低速離心機4 000 r/min離心5 min，取上清，應用Cobas 702全自動生化分析儀檢測各組小鼠BUN和Scr含量。

2.4HE染色觀察腎組織病理學的改變 采用4%多聚甲醛固定腎組織，脫水浸蠟，石蠟包埋，制成3 μm厚的石蠟切片，脫蠟透明后行HE染色，光學顯微鏡下觀察腎組織形態結構。

2.5免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)染色檢測腎組織中NGAL和cleaved caspase-3的變化 石蠟切片，常規脫蠟至水，高壓抗原修復，3% H2O2滅活組織內源性過氧化物酶20 min，正常山羊血清工作液封閉30 min，孵育 I 抗4 ℃過夜，室溫復溫30 min，室溫孵育 II 抗30 min，DAB顯色，顯微鏡觀察，蘇木素復染細胞核，自來水返藍，脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察NGAL和cleaved caspase-3的變化情況。

2.6Western blot檢測腎組織中NGAL、SMYD2、H3K36me3、p-P53、P53、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、STAT3、p-STAT3、JNK和p-JNK1/2/3等蛋白水平的變化 稱取0.020 g腎組織加入蛋白裂解液充分研磨裂解，4 ℃離心20 min取上清，應用BCA法測定蛋白濃度，配制蛋白樣本。配制SDS-PAGE凝膠，上樣、電泳、轉膜、封閉。分別加入 I 抗：NGAL(1∶800)、SMYD2(1∶500)、H3K36me3(1∶1 000)、p-P53(1∶500)、P53(1∶500)、Bax(1∶750)、Bcl-2(1∶500)、cleaved caspase-3(1∶300)、p-STAT3(1∶2 000)、STAT3(1∶1 500)、JNK(1∶1 000)、p-JNK1/2/3(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜，孵育相應II抗，TBST洗膜，ECL顯影曝光，Bio-Rad凝膠成像系統掃描，ImageJ 1.6軟件進行分析各條帶的灰度值，以β-actin為內參照，目的蛋白與β-actin的比值進行后續的統計學分析。

3 統計學處理

采用SPSS 23.0統計軟件對數據進行統計學分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較用獨立樣本t檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析法。以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 腎功能變化

與sham組相比，IR組的BUN和SCr水平顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 小鼠BUN和SCr水平

Table 1.The results of BUN and SCr in each group (Mean±SD.n=15)

GroupBUN (mmol/L)SCr (μmol/L)sham5.48±0.847.13±1.36IR65.02±6.22*157.50±9.07*

*P<0.05vssham group.

2 腎組織病理學改變

HE染色結果顯示，sham組腎小球及腎小管結構清晰，腎小管上皮細胞未見明顯水腫、脫落和壞死；IR組可見腎小管上皮細胞腫脹、脫落、壞死，腎小管上皮細胞刷狀緣脫落，管腔內大量細胞碎屑殘留，腎小球未見明顯病變，見圖1。

Figure 1.The pathophysiological changes in the kidney of mice (HE staining). The green arrow indicates edema of renal epithelial cells; the red arrow indicates the fragments of renal epithelial cells.

圖1 小鼠腎組織病理學改變

3 腎組織中NGAL和cleaved caspase-3的變化

IHC染色結果顯示，與sham組相比，IR組腎小管上皮細胞中NGAL和cleaved caspase-3明顯增多，見圖2。

4 腎組織NGAL、SMYD2、H3K36me3、p-P53、P53、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p-STAT3、STAT3、JNK和p-JNK1/2/3等蛋白水平的變化

Western blot結果顯示，與sham組相比，IR組NGAL、SMYD2和H3K36me3的蛋白水平明顯增加(P<0.05)，見圖3。IR組的p-P53、cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平明顯增加(P<0.05), Bcl-2表達水平明顯下調(P<0.05)，P53表達水平不變，見圖4。IR組的STAT3、p-STAT3、JNK和 p-JNK1/2/3的蛋白水平均明顯增加(P<0.05)，見圖5。

Figure 2.The expression of NGAL and cleaved caspase-3 proteins in the kidney of mice detected by immunohistochemical staining (×200).

圖2 小鼠腎組織NGAL和cleaved caspase-3蛋白表達

5 腎組織 H3K36me3同SMYD2和NGAL相關性分析

相關性分析結果顯示,腎組織H3K36me3同SMYD2和NGAL的變化水平均呈顯著正相關，H3K36me3與SMYD2的相關系數r=0.946(P<0.05);H3K36me3與NGAL的相關系數r=0.887(P<0.05)。

討 論

AKI作為各種大型手術和器官移植常見的嚴重并發癥，如何有效的預防和治療成為了國內外學者研究的熱點。越來越多的研究表明[11]，表觀遺傳修飾與AKI的發病機制密切相關，因此，進一步研究表觀遺傳修飾在AKI發生發展中的作用，將為AKI的防治提供新的方向。

Figure 3.The protein levels of NGAL, SMYD2 and H3K36me3 in the kidney of mice. Mean±SD.n=15.*P<0.05vssham group.

圖3 小鼠腎組織中NGAL、SMYD2和H3K36me3蛋白水平的變化

研究表明，在腎IR 24 h后，腎組織中的NGAL表達明顯增加，提示NGAL可作為AKI早期診斷的標志物[12]。本研究結果顯示，在IR誘導AKI小鼠腎組織中NGAL表達明顯增加(P<0.05)，與國內外研究結果一致[13],同時結合本研究中小鼠腎功能及腎組織形態學改變結果提示，IR-AKI小鼠模型構建成功。研究發現，單側輸尿管結扎誘導腎臟纖維化的小鼠腎組織中H3K9me1表達上調[14]，IR誘導的腎損傷小鼠腎組織中H3K4me3表達上調[15]，提示組蛋白甲基化水平增高可能與腎臟疾病的發生發展密切相關。本研究發現，在IR誘導AKI小鼠腎組織中，H3K36me3和SMYD2表達明顯增加，同時伴有小鼠腎功能障礙，腎小管上皮細胞壞死和細胞凋亡增加，提示H3K36me3表達上調可能參與了IR-AKI腎損傷的發生。目前關于H3K36me3在IR-AKI發生發展中的作用及機制尚未見其他研究報道。

Figure 4.The protein levels of p-P53， P53， cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 in the kidney of mice. Mean±SD.n=15.*P<0.05vssham group.

圖4 小鼠腎組織中p-P53、P53、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平的變化

AKI的發病機制復雜，參與因素和涉及事件眾多，包括腎近端小管損傷、氧化應激反應和炎癥反應[16]。腎近端小管損傷涉及不同的病理反應，主要包括炎癥、細胞凋亡、壞死和線粒體功能障礙等[17]。本研究結果表明，sham組小鼠腎組織中未出現明顯細胞凋亡，IR組小鼠腎組織中凋亡細胞明顯增加，且伴有腎小管上皮細胞刷狀緣脫落，管腔內大量細胞碎屑殘留，腎組織損傷明顯，提示腎IR損傷時，細胞凋亡明顯增加，參與介導了AKI的發生。細胞凋亡受多種凋亡基因及凋亡蛋白的調控，P53是介導細胞凋亡重要的調控基因之一[18]。研究表明，在腎IR損傷時，P53蛋白表達增加，可激活凋亡相關蛋白Bax的表達，抑制抗凋亡相關蛋白BCL-2蛋白的表達，介導細胞凋亡的發生[19]。本研究結果表明，在IR-AKI小鼠腎組織中p-P53蛋白及凋亡相關蛋白cleaved caspase-3和Bax表達明顯增加，抗凋亡蛋白BCL-2蛋白表達明顯下降，提示IR-AKI時，腎組織中P53表達增加，可能參與介導了細胞凋亡的產生。

大量研究表明，當腎IR損傷時可激活一系列細胞凋亡信號通路[20-22]，包括P53介導的細胞凋亡信號通路和非P53依賴的細胞凋亡信號通路。本研究結果表明，在腎IR損傷時，腎組織中p-P53、p-STAT3和p-JNK1/2/3的蛋白水平明顯增加，提示IR-AKI時，腎組織中P53表達增加，可能同時激活了STAT3和JNK相關的細胞凋亡信號通路，介導了細胞凋亡。另外，Li LX等研究發現，SMYD2和H3K36me3的上調可導致STAT3在賴氨酸685處甲基化，然后磷酸化進而活化，以調節囊性腎上皮細胞凋亡，藥物干預可減少細胞凋亡的發生[8]，但H3K36me3在IR-AKI腎損傷及腎組織細胞凋亡中的作用目前尚無相關文獻報道。本研究相關性分析結果顯示，H3K36me3與SMYD2和NGAL的水平均呈明顯正相關，結合上述結果，提示H3K36me3表達的上調可能受SMYD2的調控，其可能參與了STAT3或JNK介導的IR-AKI腎損傷及腎組織細胞凋亡的發生。

Figure 5.The protein levels of STAT3, p-STAT3, JNK and p-JNK1/2/3 in the kidney of mice. Mean±SD.n=15.*P<0.05vssham group.

圖5 小鼠腎組織中STAT3、p-STAT3、JNK和p-JNK1/2/3蛋白水平變化

綜上所述，在IR誘導小鼠AKI腎組織中H3K36me3表達上調，且與腎臟損傷及腎組織細胞凋亡的發生密切相關，H3K36me3可能與STAT3/JNK信號通路活化共同參與調控IR所致細胞凋亡發生進而導致AKI的發生過程，但具體調控機制仍需進一步研究。