IP3R在LH-EGFR誘導小鼠卵母細胞第一次減數分裂恢復中的作用*

郝肖瓊， 李延康， 付旭陽， 賈方毅

(1包頭醫學院生理學教研室， 2內蒙古包鋼醫院， 內蒙古 包頭 014040)

在排卵前卵泡中，卵泡壁層顆粒細胞表達的C型利尿鈉肽(C-type natriuretic peptide, NPPC)與表達在卵丘顆粒細胞中的利尿鈉肽受體2(natriuretic peptide receptor 2, NPR2)結合，產生的環鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)通過縫隙連接進入卵母細胞，維持了卵母細胞減數分裂的阻滯[1]。在每個生殖周期中，由下丘腦垂體前葉釋放的促黃體素(luteinizing hormone, LH)激活卵泡壁層顆粒細胞中的促黃體素受體(luteinizing hormone receptor, LHR)，導致卵母細胞減數分裂的恢復。激活LHR能夠降低NPPC mRNA的表達，同時降低了NPPC蛋白的含量[2]，而我們近期的研究發現，在NPPC存在的情況下，LH可通過降低NPR2活性誘導卵母細胞減數分裂的恢復[3]，這表明在減數分裂恢復過程中，NPR2的失活起著至關重要的作用。LH本質上通過促進顆粒細胞中表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)的表達轉激活卵丘細胞中的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)發揮作用[4]。我們近期的研究表明，LH-EGFR信號動員內質網鈣庫升高了卵丘細胞內的鈣離子水平，導致NPR2與NPPC的親和性降低，使NPR2失活，卵母細胞恢復減數分裂[3]；早期也有研究表明，在穩定表達NPR2的293T細胞系中，鈣離子能夠降低NPR2的磷酸化水平，使NPR2失活[5]。這些結果說明鈣離子在降低NPR2活性的過程中發揮著重要作用，然而，LH-EGFR信號究竟怎樣升高卵丘細胞內鈣離子水平誘導卵母細胞減數分裂恢復，目前還不清楚。

細胞內鈣庫儲存在內質網的膜系統中，胞內鈣庫的釋放是由多種通路調控的，磷脂酰肌醇信號通路是十分重要的一種，許多胞外刺激物可激活磷脂酰肌醇信號通路，導致1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, IP3R)介導鈣庫釋放鈣離子[6]。IP3R是一種位于內質網的鈣離子釋放通道[7]，廣泛表達于基本所有類型的細胞中[8]。由IP3R調節的鈣離子釋放過程對許多胞內活動十分重要,如基因轉錄、細胞增殖、受精、發育、細胞凋亡細胞間通訊和激素分泌等[9]。

在本研究中，我們證明了LH-EGFR信號通路通過IP3R升高卵丘細胞內的鈣離子水平，從而使NPR2失活，cGMP下降，導致卵母細胞減數分裂恢復。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

21～23日齡(12～14 g)雌性C57BL/6J小鼠共150只，全部用于注射孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)，之后取卵巢內卵丘-卵母細胞復合物(cumulus-oocyte complexes, COCs)用于實驗。小鼠購于中科院遺傳所實驗動物中心，許可證號為SCXK (京) 2015-0019，于SPF級實驗動物房飼養，22～24 ℃恒溫，12 h/12 h交替光照/黑暗，自由采食飲水。

2 實驗試劑與儀器

PMSG(浙江寧波激素廠);NPPC、EGF、2-氨乙基二苯基硼酸酯(2-aminoethyl diphenyl borate, 2-APB)、肝素(heparin)和LH(Sigma)；Fluo 3-AM(日本同仁化學研究所)；MEMα粉末狀培養基(Gibco)；胎牛血清(FBS;Thermo)；RNA提取試劑盒RNeasy Micro Kit和RNA反轉錄試劑盒QuantiTect (Qiagen)；TransStart Green qPCR SuperMix(全式金公司)；cGMP檢測試劑盒(Cayman)。

體式鏡 (Lecia)；A1激光共聚焦顯微鏡(Nikon)；real-time PCR儀(Appiled Biosystems)；細胞培養膜(Millipore)。

3 實驗方法

3.1COCs的分離及培養 小鼠腹腔注射PMSG,每只5 U，44～48 h后頸椎脫臼處死，分離卵巢，刺破卵泡，挑選形態良好，卵丘細胞包裹均勻的COCs。實驗分組如下：對照(control)組(僅添加30 nmol/L NPPC)、NPPC+10 μg/L EGF組、NPPC+10 μg/L EGF+不同劑量2-APB組、NPPC+10 μg/L EGF+不同劑量Heparin組、10 μmol/L 2-APB組以及200 mg/L heparin組，將COCs置于按實驗分組不同預先添加了不同試劑的MEMα培養液中，于37 ℃、5% CO2培養箱進行培養；培養4 h后，將卵丘細胞去掉，觀察并統計卵母細胞生發泡破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD)的百分率(GVBD%)，卵母細胞內無明顯生發泡(germinal vesicle, GV)即認為發生GVBD，GVBD%代表卵母細胞減數分裂恢復情況。每次實驗每組使用30枚COCs。

3.2卵泡的分離及培養 卵巢取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，用1 mL注射器分離卵泡，選擇直徑約為300～400 μm、反應良好的卵泡，將分離好的卵泡置于孔徑0.44 μm的細胞培養膜上。實驗分為4組：control組、1 mg/L LH組、 LH+10 μmol/L 2-APB組以及LH+200 mg/L heparin組。培養膜懸浮放置在按實驗分組不同預先添加不同試劑的MEMα培養液中，于37 ℃、5% CO2培養箱進行培養；4 h后，刺破卵泡，將卵丘細胞去掉以觀察卵母細胞減數分裂恢復情況。每次實驗每組使用15枚卵泡。

3.3卵丘擴展 COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，實驗分為4組：control組(僅添加30 nmol/L NPPC)、NPPC+10 μg/L EGF組、NPPC+10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB以及NPPC+10 μg/L EGF+200 μmol/L heparin組。MEMα培養液按處理組不同預先添加不同試劑待用，各組培養液額外添加5% FBS幫助細胞貼壁；吸取按不同實驗處理組準備好的添加了不同試劑的培養液制作微滴，每個微滴體積10 μL，微滴置于玻底培養皿中以便后續拍照記錄，將COCs置于不同處理組的微滴中，覆蓋石蠟油，于37 ℃，5% CO2培養箱進行培養；12～16 h后結束培養，觀察卵丘擴展情況。每次實驗每組使用15枚COCs。

3.4RNA的提取 COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，實驗分組同3.3，COCs置于按實驗分組不同預先添加不同試劑的MEMα培養液中培養，6 h后，收集COCs，總RNA提取依照RNeasy Micro Kit操作指南進行，總RNA的反轉錄依照QuantiTect反轉錄體系進行，得到cDNA。

3.5real-time PCR 采用25 μL體系：TransStart Green qPCR SuperMix 12.5 μL，Forward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，Dye 0.5 μL，ddH2O 8 μL，cDNA 2 μL。在ABI 7500 Real-Time PCR系統下進行反應，每個樣品重復3次，所有實驗重復3次。實驗所用引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，序列見表1。

表1 Real-time PCR 引物序列

F: forward; R: reverse.

3.6細胞內鈣離子水平檢測 COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，實驗分組同3.3，COCs置于按實驗分組不同預先添加不同試劑的MEMα培養液中培養2 h，PBS清洗，加入5 μmol/L鈣離子熒光探針Fluo 3-AM，于37 ℃、5% CO2培養箱孵育20 min，之后PBS清洗，在A1激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內鈣離子水平，綠色熒光表示胞內鈣離子水平，熒光強度代表胞內鈣離子水平相對值。每次實驗每組使用15枚COCs。

3.7cGMP水平檢測 COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，實驗分組同3.3，COCs置于按實驗分組不同預先添加不同試劑的MEMα培養液中培養(每組需100枚COCs)，2 h后結束培養，PBS清洗，收集各組COCs，cGMP含量依據cGMP酶聯免疫試劑盒(Cayman)中提供的方法進行檢測。

4 統計學處理

實驗數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，統計推斷采用方差分析(ANOVA)和SNK-q檢驗，用SigmaPlot 13.0軟件進行統計分析并作圖，以P<0.05為差異具有統計學顯著性。

結 果

1 IP3R抑制劑2-APB和heparin抑制EGF誘導的卵母細胞減數分裂恢復

IP3R是一種調控內質網鈣庫鈣離子釋放的重要通道。我們研究了EGF是否通過IP3R升高胞內鈣離子水平。結果表明，EGF促進了卵母細胞減數分裂的恢復，GVBD%為(91.42±0.72)%，而IP3R的抑制劑2-APB和heparin能有效抑制EGF誘導的卵母細胞減數分裂恢復(P<0.05)，GVBD%分別為(52.58±1.45)%和(47±1.22)%,見圖1A；且2-APB與Heparin的抑制作用是劑量依賴性的,見圖1B、C。這些結果表明，IP3R在EGF誘導的卵母細胞減數分裂恢復中發揮重要作用。

2 IP3R抑制劑2-APB和heparin抑制EGF誘導的卵丘擴展

EGF在誘導卵母細胞減數分裂恢復的過程中伴隨著卵丘擴展，卵丘擴展對于卵子的正常受精至關重要。因此，我們檢測了2-APB及heparin在EGF誘導的卵丘擴展中的作用。結果表明，與對照組相比，EGF促進了卵丘細胞的擴展與卵丘擴展因子的表達，而2-APB及heparin均能顯著抑制EGF誘導的卵丘擴展現象，且卵丘擴展因子Has2、Ptgs2、Ptx3與Tnfaip6的表達量較EGF組均顯著降低(P<0.05)，見圖2。這一結果表明IP3R也參與了EGF誘導的卵丘擴展。EGF誘導減數分裂恢復與卵丘擴展往往并行，且有研究表明，鈣離子在卵丘擴展過程中也發揮重要作用[10]。本結果進一步說明了IP3R在減數分裂恢復過程中的重要意義。

Figure 1.The effect of 2-APB and heparin on EGF-induced meiotic resumption. A: COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin; B: the dose-dependent effects of 2-APB on oocyte meiotic resumption; C: the dose-dependent effects of he-parin on oocyte meiotic resumption. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group;△P<0.05vs2-APB group;▲P<0.05vsheparin group.

圖1 2-APB及heparin對EGF誘導卵母細胞減數分裂恢復的影響

3 IP3R抑制劑2-APB和heparin抑制EGF誘導的卵丘細胞內鈣離子水平升高

激活IP3R鈣離子通道導致細胞內鈣離子水平升高，接下來我們研究了2-APB和heparin對EGF誘導的胞內鈣離子水平升高的影響，鈣離子探針Fluo 3-AM作為胞內鈣離子水平變化的指示劑。研究結果表明，對照組鈣離子熒光(綠色熒光)強度微弱，添加EGF后，卵丘細胞內鈣離子熒光強度明顯增加，這與之前的研究[11]結果相同，接著，我們添加了2-APB和heparin，發現這2種抑制劑均能明顯抑制EGF誘導的胞內鈣離子水平升高，且鈣離子熒光強度也顯著降低(P<0.05),見圖3。這些結果表明，EGF可能通過激活IP3R鈣離子通道導致卵丘胞內鈣離子水平升高，誘導卵母細胞減數分裂恢復，若阻斷IP3R的作用，則EGF不能誘導胞內鈣離子水平的升高，那么卵母細胞也無法恢復減數分裂。

4 IP3R抑制劑2-APB和heparin對COCs中cGMP水平的影響

NPPC處理后COCs中cGMP水平是否升高能夠代表NPR2鳥苷酸環化酶的活性，卵丘細胞內鈣離子水平升高誘導卵母細胞減數分裂恢復，本質上是高水平的鈣離子導致了NPR2的失活，使cGMP水平下降。因此，我們研究了2-APB和heparin在EGF誘導減數分裂恢復過程中對COCs內cGMP水平的影響。同之前的研究[1]結果一致，NPPC處理2 h后，COCs中cGMP含量明顯上升，添加EGF降低了胞內cGMP水平(P<0.05)，然而，EGF的降低作用能夠被2-APB和heparin顯著逆轉(P<0.05),見圖4。這一結果表明，EGF通過IP3R升高卵丘細胞內鈣離子水平，使NPR2失活，cGMP水平下降，最終誘導卵母細胞減數分裂的恢復。

Figure 2.The effect of 2-APB and heparin on EGF-enabled cumulus expansion.COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin. A: morphological changes of cumulus expansion with different treatments after 12～16 h of culture; B: real-time PCR results forHas2,Ptgs2,Ptx3andTnfaip6in cumulus cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

圖2 2-APB及heparin對EGF誘導的卵丘擴展的影響

Figure 3.The effect of 2-APB and heparin on EGF-mediated calcium elevation.COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin.Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

圖3 2-APB及Heparin對EGF誘導卵丘細胞內鈣離子水平升高的影響

Figure 4.The effect of 2-APB and heparin on cGMP level in COCs.COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

圖4 2-APB及heparin對COCs內cGMP水平的影響

5 IP3R抑制劑2-APB和heparin抑制LH誘導的卵母細胞減數分裂恢復

前面的研究中，我們在COCs體外培養模型下，證明EGF通過IP3R升高胞內鈣離子水平，使NPR2失活，導致cGMP水平的下降，卵母細胞減數分裂恢復。為了進一步模擬生理環境，我們使用卵泡培養模型，探究IP3R在LH誘導的卵母細胞減數分裂恢復過程中是否發揮作用。研究結果表明，LH促進減數分裂的恢復，GVBD%為(91.00±1.15)%，而2-APB和heparin顯著抑制了LH誘導的減數分裂恢復(P<0.05)，GVBD%分別(51.33±1.45)%和(46.75±0.94)%，見圖5。LH本質上通過激活EGFR發揮作用，因此，本結果證明LH-EGFR信號確實通過IP3R升高胞內鈣離子水平，使NPR2失活，cGMP水平下降，減數分裂恢復。

討 論

排卵前卵泡中的卵母細胞一直阻滯在減數分裂I前期的雙線期，NPPC與其受體NPR2結合，產生的cGMP是維持減數分裂阻滯的關鍵因子[1]，LH通過促進顆粒細胞中EGF樣生長因子的表達[12]，轉激活卵丘細胞中的EGFR，誘導卵母細胞恢復減數分裂[4]。前期的研究表明，激活EGFR升高卵丘細胞內鈣離子水平，導致NPR2與NPPC的親和性下降，使NPR2失活，cGMP水平下降，卵母細胞恢復減數分裂。本研究中，我們發現LH-EGFR信號通過IP3R升高卵丘細胞內鈣離子水平，誘導卵母細胞減數分裂的恢復。

Figure 5.The effect of 2-APB and heparin on LH-induced meio-tic resumption. Follicles were cultured with MEMα medium alone, or supplemented with 1 mg/L LH, 1 mg/L LH+10 μmol/L 2-APB or 1 mg/L LH+200 mg/L heparin. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

圖5 2-APB及heparin對LH誘導的減數分裂恢復的影響

細胞內鈣信號作為調節細胞活動的重要信使，參與了多種細胞生理反應。胞內高水平鈣離子一方面來源于質膜鈣泵的開放，使胞外鈣離子內流，另一方面來源于內質網鈣庫的釋放。我們前期的研究已經證明，激活EGFR升高卵丘細胞內鈣離子水平，使NPR2失活，cGMP水平下降，卵母細胞恢復減數分裂，而EGF誘導的卵丘細胞內高水平鈣離子來源于內質網鈣庫的釋放[3]。IP3R和蘭尼堿受體(ryano-dine receptor, RyR)均為內質網鈣釋放通道，我們發現RyR的抑制劑tetracaine并不能抑制EGF誘導的卵母細胞減數分裂恢復(結果未顯示)，然而，IP3R的抑制劑2-APB和heparin卻能劑量依賴性的抑制EGF誘導的減數分裂恢復，此外，2-APB和heparin有效抑制了EGF升高的卵丘細胞內鈣離子水平，鈣離子水平的升高是EGF促進減數分裂恢復的關鍵原因。這些結果表明IP3R在EGF誘導的卵母細胞減數分裂恢復中發揮作用，EGF激活IP3R鈣離子通道，使內質網鈣庫釋放鈣離子，導致了卵丘細胞內具有高水平鈣離子。然而，2-APB和heparin并不能完全逆轉EGF誘導的減數分裂恢復，提示可能還有其它互補途徑，這需要進一步的研究。

我們發現2-APB和heparin同樣能夠抑制EGF誘導的卵丘細胞擴展，卵丘擴展與卵母細胞減數分裂恢復的時空調控對于正常的排卵進程至關重要，而激活IP3R鈣離子通道升高了胞內鈣離子水平，說明鈣離子可能也參與了EGF誘導的卵丘擴展，這與之前的報道一致[10]，同時，這些結果也表明了鈣離子對減數分裂的作用不僅是單一的促成熟，還能夠促進卵丘擴展，鈣離子的這些作用能夠確保卵子正常的成熟與排卵。

EGF通過IP3R升高卵丘細胞內鈣離子水平，而鈣離子的重要意義在于使NPR2失活，導致cGMP水平下降，最終破壞卵母細胞減數分裂的阻滯狀態[13-14]。2-APB和heparin不但抑制了EGF誘導的卵丘細胞內鈣離子水平升高，還能夠有效逆轉EGF介導的胞內cGMP水平降低，這說明IP3R介導的卵丘細胞內高水平鈣離子導致了NPR2的失活，使cGMP水平下降，最終促進卵母細胞減數分裂的恢復。之前的結果表明鈣離子可使NPR2失活[15]，我們的結果也與之一致。

由于卵丘細胞不表達LH受體，因此，LH主要通過激活卵丘細胞中的EGFR發揮作用，2-APB和he-parin同樣抑制了LH誘導的減數分裂恢復，之前的研究表明LH處理升高了卵丘細胞內鈣離子水平導致NPR2失活[3]，結合此結果，說明LH-EGFR信號通過IP3R升高卵丘細胞內鈣離子水平，高水平鈣離子使NPR2失活，cGMP水平下降，最終誘導卵母細胞減數分裂的恢復。

本研究結果進一步闡明了卵母細胞減數分裂恢復的分子機理，為臨床輔助生殖中建立更為完善的卵母細胞體外成熟體系、提高卵母細胞體外成熟質量提供了科學依據。

致謝：感謝中國農業大學生物學院張美佳教授在論文寫作過程中給予的指導。