CD14、IL-4和TNF-α在健康人和慢性根尖周病患者組織中的免疫熒光定位*

王 剛， 李 娟， 黃世光

(1中山大學附屬中山醫院口腔分院牙體牙髓病科， 廣東 中山 528404； 2暨南大學口腔醫學院， 廣東 廣州 510632)

慢性根尖周病是由來自感染根管的感染刺激引起的宿主免疫反應，在根尖周病損組織中存在的各種炎癥細胞、細胞因子和趨化因子可導致根尖周膠原纖維破壞，形成持續的炎癥并伴隨骨質的破壞吸收。研究顯示，在人根尖周的病變組織中存在著大量的淋巴細胞(lymphocytes, LYMs)、中性粒細胞(neutrophil granulocytes)、巨噬細胞(macrophages, M?)和漿細胞(plasma cells)等，另外可見成纖維細胞(fibroblasts, FBs)增生，新生的毛細血管常襯以腫脹的內皮細胞(endothelial cells, ECs)[1]。白細胞分化抗原14(cluster of differentiation 14, CD14)存在膜結合CD14(membrane-bound CD14, mCD14)和可溶性CD14(soluble CD14, sCD14)2種形式，mCD14主要表達于活化的中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、成熟單核細胞以及人牙齦成纖維細胞中[2]。白細胞介素4(interleukin-4, IL-4)是由Th2細胞分泌的細胞因子，能刺激活化B細胞和T細胞增殖、 CD4+T細胞分化成II型輔助T細胞，在調節體液免疫和適應性免疫中起關鍵作用。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)及IL-4參與了Th細胞免疫應答的調控過程[3-4]。IL-4是一種多功能細胞因子，可抑制T淋巴細胞功能以及單核/巨噬細胞的活化和效應作用，抑制Th1細胞因子，從而發揮抑炎作用, 促進根尖周組織的修復和局限炎癥的免疫應答機制[3]。TNF-α主要是由活化的巨噬細胞分泌，中性粒細胞、NK細胞、成纖維細胞以及肥大細胞也可分泌TNF-α，并且對其免疫功能作出調節，在根尖周病變中起著骨破壞的作用[4-5]。根尖周病變的發病及修復機制非常復雜，目前，尚未見人慢性根尖周病組織中TNF-α-CD14和IL-4-CD14雙陽性細胞表達的報道。因此，本實驗采用免疫熒光雙染色法，觀察TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細胞在不同類型慢性根尖周病組織中的表達情況，并探討TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細胞在慢性根尖周炎發病機制中的作用。

材 料 和 方 法

1 主要材料和儀器

Mouse Anti-CD14(Santa Cruz)；Rabbit Anti-TNF-α和Rabbit Anti-IL-4(Abcam)；山羊抗鼠IgG(H+L) Alex Flour?555(Cell Signaling Technology)；山羊抗兔IgG(H+L)Alex Flour?488(Cell Signaling Technology)；4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; MP Biomedicals)；DAB顯色試劑盒(ZLI-9019, 北京中杉金橋生物技術有限公司)。激光共聚焦顯微鏡(ZEISS)。

2 方法

2.1病例選擇 選擇2015年10月～2017年6月在中山大學附屬中山醫院口腔分院牙體牙髓病科并自愿接受本研究的病例，其中男性45例，年齡(38.0±12.5)歲，女性43例，年齡(34.0±14.5)歲,其中43例為臨床診斷為根尖囊腫或慢性根尖周膿腫，接受根尖手術治療或無法保留的病例，慢性根尖周膿腫23例，根尖周囊腫為20例。對照組為因正畸需要拔除的前磨牙及健康無冠周炎的第三磨牙，病例數為45例[年齡(32.0±18.4)歲]。患者年齡及性別均無顯著差異(P>0.05)。收集患者病歷時，各組男女比例和年齡層，在兩個層次上無統計學差異。所有選取女性病例均否認懷孕、服用長效或短效避孕藥病史；所有患者排除心血管或其他系統性疾病，并且至少3個月內未服用抗生素治療。所有患者均需要簽署知情同意書。

2.2實驗分組 實驗分為：(1)正常對照(healthy control)組(45例)：因正畸治療需要拔除的牙周健康的前磨牙或沒有冠周炎的智齒牙周膜組織，X線示根尖影像無明顯異常，根尖孔發育完成，牙周膜影像光滑連續，無增寬;(2)慢性根尖周膿腫(chronic periapical abscess)組(23例)：因根管治療效果不佳而行根尖刮治術或根尖切除術的刮除的根尖肉芽組織，或因牙槽骨吸收破壞嚴重導致無法保留需要拔除的患牙根尖肉芽組織，X線示根尖區典型的大片云霧狀透射陰影;(3)根尖周囊腫(periapical cyst)組(20例)：X 線片顯示患牙根尖周有圓形或橢圓形密度降低區，直徑>1 cm，邊界清楚有骨白線包繞，手術過程中觀察到根尖區病變組織為內含液體或半固體的囊性組織。

2.3組織標本采集和處理 根尖周組織標本置于10%中性福爾馬林固定液中浸泡24～48 h，制作5 μm厚度的連續切片，行HE染色，光學顯微鏡下觀察各組的組織學變化。

2.4TNF-α-CD14和IL-4-CD14雙陽性細胞免疫熒光雙染色 Ⅰ抗為Mouse Anti-CD14、Rabbit Anti-TNF-α和Rabbit Anti-IL-4，稀釋度為1∶100；Ⅱ抗為山羊抗鼠IgG(H+L) Alex Flour? 555和山羊抗兔IgG(H+L)Alex Flour? 488，稀釋度為1∶200。組織切片經檸檬酸液修復，Ⅱ抗血清封閉，Ⅰ抗孵育，避光條件下Ⅱ抗孵育熒光染色，DAPI核染后，熒光顯微鏡觀察。TNF-α和IL-4陽性信號為紅色熒光， CD14免疫熒光陽性信號顯現為綠色熒光，定位于細胞膜或細胞漿，同一視野下紅色熒光與綠色熒光重疊后為橘黃色熒光；細胞核顯現為藍色熒光。組織切片由2名病理醫師于熒光顯微鏡下盲法觀察，參照李娟等[6]的計數方法，選取10個代表性連續視野(0.072 5 mm2/視野)，對DAPI陽性及表達TNF-α-CD14或IL-4-CD14雙陽性細胞進行計數，獲得雙陽性細胞的密度(cells/mm2)，取平均值[7-8]。

3 統計學處理

數據以均數±標準誤(mean±SEM)形式表示，采用統計軟件SPSS 13.0分析處理。各組標本組織中TNF-α-CD14和IL-4-CD14雙陽性細胞平均密度的比較采用完全隨機設計的單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Levene法進行方差齊性檢驗。若方差齊時，多個樣本均數間每兩個均數的比較選用Bonferroni法；方差不齊時選用Tamhane’s T2法[6]。以P<0.05認為差異有統計學意義。

結 果

1 各組HE染色結果

各組標本組織結果顯示，正常對照組牙周膜組織主要由纖維構成，組織結構及形態基本完好；慢性根尖周膿腫組可見炎性肉芽組織，毛細血管和成纖維細胞增生，中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞和巨噬細胞等炎癥細胞浸潤，部分病變內部見上皮條索及上皮島；根尖周囊腫組可見大塊囊性結構組織，炎性肉芽包饒中央壞死崩解結構，纖維組織層以膠原纖維為主，肉芽組織細胞間水腫，囊壁上皮層下大量慢性炎癥細胞浸潤，含典型的鐵血黃素和膽固醇晶體，見圖1。

Figure 1.Histological changes of human periapical tissues (HE staining, the scale bar=50 μm). A: healthy control group; B: chronic periapical abscess group; C: fibrous layer of periapical cyst group; D: epithelium layer of periapical cyst group.

圖1 各組樣本HE染色結果

2 TNF-α-CD14雙陽性細胞雙染色結果

各組標本組織中TNF-α-CD14雙陽性細胞雙染色結果顯示，正常對照組僅見少量散在分布的TNF-α-CD14雙陽性細胞；根尖周囊腫組TNF-α-CD14雙陽性細胞數量比正常對照組明顯增加；慢性根尖周膿腫組中可見大量浸潤的TNF-α-CD14雙陽性細胞，見圖2～4。

3 IL-4-CD14雙陽性細胞雙染色結果

各組標本組織中IL-4-CD14雙陽性細胞雙染色結果顯示，正常對照組僅見少量散在分布的IL-4-CD14雙陽性細胞；慢性根尖周膿腫組IL-4-CD14雙陽性細胞數量比正常對照組明顯增加；根尖周囊腫組中可見大量浸潤的IL-4-CD14雙陽性細胞，見圖5～7。

Figure 2.TNF-α-CD14 double-positive cell staining results of healthy control group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: TNF-α+; C: DAPI+; D: merged.

圖2 健康對照組TNF-α-CD14雙陽性細胞雙染色結果

Figure 3.TNF-α-CD14 double-positive cell staining results of chronic periapical abscess group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: TNF-α+; C: DAPI+; D: merged.

圖3 慢性根尖周膿腫組TNF-α-CD14雙陽性細胞雙染色結果

4 TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細胞密度的比較結果

各組標本組織中TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細胞密度比較，結果顯示：(1)2組慢性根尖周病組織中TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細胞密度較正常對照組顯著升高(P<0.05)；(2)慢性根尖膿腫組TNF-α-CD14雙陽性細胞密度較根尖周囊腫組顯著升高(P<0.05)；(3)根尖周囊腫組IL-4-CD14雙陽性細胞密度較慢性根尖膿腫組顯著升高(P<0.05),見圖8、9。

Figure 4.TNF-α-CD14 double-positive cell staining results of periapical cyst group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: TNF-α+; C: DAPI+; D: merged.

圖4 根尖周囊腫組TNF-α-CD14雙陽性細胞雙染色結果

Figure 5.IL-4-CD14 double-positive cell staining results of healthy control group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: IL-4+; C: DAPI+; D: merged.

圖5 健康對照組IL-4-CD14雙陽性細胞雙染色結果

討 論

慢性根尖周炎的主要病理特征是炎癥細胞的浸潤及牙槽骨的吸收破壞[9]。促炎和抗炎細胞因子參與了根尖周疾病的介導及調控，炎癥性骨吸收是由根尖周組織中的炎癥或免疫細胞及其分泌的各種不同細胞因子所致，是免疫細胞、細胞因子以及其它炎性介質相互之間高度復雜共同作用的結果[10-11]。成骨與破骨的動態平衡是根尖周骨重建過程中的關鍵性環節[12]。

Figure 6.IL-4-CD14 double-positive cell staining results of chronic periapical abscess group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: IL-4+; C: DAPI+; D: merged.

圖6 慢性根尖周膿腫組IL-4-CD14雙陽性細胞雙染色結果

Figure 7.IL-4-CD14 double-positive cell staining results of periapical cyst group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: IL-4+; C: DAPI+; D: merged.

圖7 根尖周囊腫組IL-4-CD14雙陽性細胞雙染色結果

在本研究中，我們采集了慢性根尖周膿腫和根尖周囊腫的標本，以正常牙周膜組織作為對照。通過HE染色觀察比較各組標本根尖周的組織學改變及炎癥細胞浸潤狀態。最近的研究結果表明，Th1和Th2細胞因子在慢性根尖周炎的發病機制中發揮作用。Th1免疫應答參與了根尖周病變和骨質破壞的進展，而Th2細胞因子介導的炎癥免疫機制在病變發展晚期發生的愈合過程中發揮重要作用[13-14]。然而，調節這些免疫炎癥通路的機制尚未完全闡明。de Carvalho Fraga 等[15]觀察到在根尖周囊腫中IFN-γ蛋白水平升高，而根尖肉芽腫中的IL-4表達更強。Ribeiro 等[12]通過檢測根尖周囊腫中M2巨噬細胞和促炎細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表達，評價Th1和Th2反應在根尖周囊腫中的作用。結果提示M2巨噬細胞參與根尖周囊腫的炎癥反應，同時存在促炎的Th1相關細胞因子，表明促炎Th1因子和抑炎Th2因子驅動的免疫反應在根尖周病變中共存。研究表明，促炎Th1和抑炎Th2細胞因子均可調節IL-1的表達，IL-1被認為是骨破壞的中心介體，IL-6刺激骨吸收，而IL-4和IFN-γ對破骨細胞產生抑制作用，IL-4抑制促炎細胞因子(包括IL-1和TNF-α)的合成，TNF-α及IL-4參與了Th細胞免疫應答的調控過程[4, 10, 15-17]。

Figure 8.The density of TNF-α-CD14 double-positive cells. Mean±SEM.*P<0.05vshealthy control group;▲P<0.05vschronic periapical abscess group.

圖8 各組根尖周組織TNF-α-CD14雙陽性細胞密度的比較

Figure 9.The density of IL-4-CD14 double-positive cells. Mean±SEM.*P<0.05vshealthy control group;▲P<0.05vschronic periapical abscess group.

圖9 各組根尖周組織IL-4-CD14雙陽性細胞密度的比較

目前，尚未見人慢性根尖周炎組織中TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細胞表達的報道。為進一步研究CD14陽性細胞Th1和Th2極化情況，本實驗選擇TNF-α作為Th1細胞因子，IL-4為Th2細胞因子，采用免疫熒光雙染色法，觀察不同類型慢性根尖周病組織中TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細胞的分布并分析雙陽性細胞的密度。本實驗結果與Araujo-Pires等[18]和Fukada 等[19]的結果相似，Araujo-Pires等[18]觀察到，根尖周病變的活動性與促炎介質如TNF-α、IL-21、IL-17和IFN-γ的高表達相關，而病變的非活動期與抑炎介質如Foxp3、IL-10、IL-9、IL-4和IL-22的表達相關。Fukada 等[19]的結果提示，炎癥肉芽腫的破骨細胞活性與Th1反應相關，根尖周囊腫與Th2活性增強相關，但他們的報道并未分析具體免疫細胞炎癥介質的表達情況。Rider等[20]研究表明，TLR2、TLR4和CD14是調節感染根管的混合感染及其所致根尖周組織破壞的關鍵因素。

綜上所述，TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細胞如何參與根尖周病的免疫調控機制尚不清楚。根尖周組織中Th細胞因子的表達對根尖周病免疫病理的調節，以及Th1/Th2細胞因子間相互作用的機制尚需進一步探究。