不可分型流感嗜血桿菌經NF-κB信號通路抑制組蛋白脫乙酰酶活性促進支氣管上皮炎癥反應*

付 曉， 李 慕， 文 平

(邵陽學院基礎醫學院， 湖南 邵陽 422000)

不可分型流感嗜血桿菌(nontypeableHemophilusinfluenzae，NTHi)是一種革蘭陰性致病菌，其廣泛分布于上、下呼吸道內，是引起人類呼吸道感染性疾病的主要原因之一[1]。NTHi可導致包括急性中耳炎、囊性纖維化以及獲得性肺炎等在內的呼吸道疾病，同時也可引起慢性支氣管炎和慢性下呼吸道阻塞性肺病等慢性疾病[2]。此外，NTHi還是發展中國家兒童住院的最常見病因[3]。然而，由于NTHi不含莢膜且具有獨特的耐藥機制，到目前為止我們仍不清楚NTHi具體的致病機制[4]。而考慮到NTHi在臨床的高發病率，探究NTHi的致病機制對于預防治療NTHi引起的疾病至關重要。

組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)是一類能夠修飾染色體結構并調控基因表達的重要蛋白酶[5]。研究表明，組蛋白乙酰化能夠促進DNA與組蛋白八聚體的解離，從而使轉錄因子與DNA結合位點特異性結合，進而激活相關基因的轉錄[6]。目前已經證實，HDAC能夠顯著下調某些炎癥細胞因子的轉錄水平，從而抑制炎癥反應的發生[7]。但HDAC在NTHi引起呼吸道炎癥反應中的作用尚未明確。本研究中，我們對NTHi感染支氣管上皮細胞后的炎癥反應分子機制進行了體外研究，旨在為進一步完善NTHi的致病機制提供參考。

材 料 和 方 法

1 菌株與細胞株

不可分型流感嗜血桿菌(ATCC-49247)購自ATCC；人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B購自中科院細胞庫。

2 主要實驗材料

人白細胞介素8 (interleckin-8, IL-8)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)檢測試劑盒購自Invitrogen；核蛋白和細胞核提取試劑盒購自Thermo Fisher；HDAC活性檢測試劑盒和染色質免疫沉淀試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司；抗IκBα、Ac-H3、Ac-H4、HDAC1和HDAC2抗體購自Cell Signaling Technology；NF-κB抑制劑BAY 11-7082和HDAC抑制劑trichostatin A(TSA)購自Santa Cruz；DMEM培養液購自上海生物工程股份有限公司。

3 主要方法

3.1細胞培養與NTHi感染 BEAS-2B細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液，在培養液中加入1%的青霉素-鏈霉素混合液后于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。培養24～48 h待細胞生長密度為80%～90%時，加入MOI=10的NTHi后，分別于感染后0、4、8、12、16和24 h收集細胞以及細胞上清進行后續實驗。

3.2ELISA檢測細胞因子 按照上述處理后收集細胞上清，并按照人IL-8和GM-CSF ELISA 試劑盒說明書測定細胞上清中IL-8和GM-CSF的含量。最后用酶標儀于450 nm處檢測各組細胞樣本的吸光度(A)值，每次實驗重復3次。最后通過試劑盒中標準品的檢測結果制備標準曲線，并計算各細胞上清中IL-8和GM-CSF的濃度。

3.3RT-qPCR實驗 收集處理后的細胞，提取細胞總RNA，隨后進行RNA純化并將其逆轉錄為cDNA。轉錄完成后按照30 μL的qPCR反應體系進行擴增。IL-8的上游引物序列為5’-AGCTCTGTGTGAAGGTGCAGT-3’，下游引物序列為5’-AATTTCTGTGTTGGCGCAGT-3’；GM-CSF的上游引物序列為5’-GAACGAAAAGAACGAAGACGTAG-3’，下游引物序列為5’-TTATGAAATCCTCAAAGGTGGTG-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3’，下游引物序列為5’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’。擴增完畢后，使用2-ΔΔCt法計算IL-8和GM-CSF mRNA的相對表達量。

3.4Western blot檢測 收集處理后的細胞，提取細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度后取10 μL進行SDS-PAGE，并于10 V條件下轉膜儀中轉膜40 min。轉膜完成后于5%脫脂奶粉中封閉過夜。隨后用稀釋好的Ⅰ抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后，再加入稀釋好的Ⅱ抗室溫孵育1 h。TBST洗膜5次后于顯影儀中進行ECL發光顯影。

3.5電泳遷移率變動分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA) 收集處理后的細胞，采用核蛋白提取試劑盒提取細胞核蛋白。隨后按照說明書要求將細胞核提取物與探針標記的寡核苷酸混合后37℃反應10 min。反應完成后，加入終止液終止反應并進行SDS-PAGE，最后通過紅外成像系統進行結果分析。

3.6染色質免疫沉淀檢測 收集處理后的BEAS-2B細胞，按照染色質免疫沉淀試劑盒說明書進行檢測。具體操作如下：在細胞中細胞加入0.5 mL 37%的甲醛，37 ℃孵育10 min。隨后加甘氨酸至終濃度為0.125 mol/L。混勻后，在室溫下放置5 min。超聲破碎細胞后離心收集沉淀，隨后加入相應抗體進行PCR分析。

3.7HDAC活性檢測 BEAS-2B細胞經過上述處理后，采用細胞核提取試劑盒提取BEAS-2B細胞核。并按照HDAC活性檢測試劑盒說明書進行測定，最后通過熒光顯微鏡檢測其熒光強度，以計算HDAC活性。

4 統計學處理

本實驗分析均采用SPSS 18.0軟件。所有統計數據均以平均值±標準差(mean±SD)表示，組間數據比較均采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 NTHi誘導支氣管上皮細胞表達IL-8和GM-CSF

MOI=10的NTHi感染BEAS-2B細胞0、4、12和24 h后，檢測細胞內IL-8和GM-CSF的表達水平。ELISA結果顯示，細胞上清中IL-8和GM-CSF分泌水平顯著上升(P<0.05),見圖1A、B。而RT-qPCR結果與ELISA結果相同，NTHi感染4 h后，細胞內IL-8和GM-CSF的mRNA表達水平也顯著增高(P<0.05),見圖1C。

Figure 1.The expression of IL-8 and GM-CSF in the bronchial epithelial cells induced by NTHi. A and B: the levels of IL-8 and GM-CSF were detected by ELISA; B: the mRNA expression of IL-8 and GM-CSF was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group．

圖1 NTHi誘導支氣管上皮細胞表達IL-8和GM-CSF

2 NTHi誘導IL-8和GM-CSF分泌與NF-κB有關

Western blot結果顯示，NTHi感染BEAS-2B細胞30和60 min后，胞漿內總IκBα的表達顯著下調，見圖2A；而EMSA結果也顯示，NTHi感染60和120 min可顯著增強細胞內NF-κB的DNA結合活性，見圖2B；進一步采用10 μmol/L NF-κB抑制劑BAY 11-7082預處理后，BEAS-2B細胞內GM-CSF和IL-8的表達水平均顯著降低(P<0.05)，見圖2C。

3 NTHi誘導BEAS-2B細胞組蛋白磷酸乙酰化

Western blot檢測NTHi感染后細胞內的組蛋白磷酸乙酰化水平。結果顯示，NTHi感染BEAS-2B細胞60和120 min可顯著誘導細胞內組蛋白H3和H4的磷酸乙酰化,見圖3A。而染色質共沉淀結果也顯示，NTHi感染可促進IL-8和RNA聚合酶II的結合，見圖3B。

4 NTHi下調BEAS-2B細胞內HDAC表達與活性

MOI=10的NTHi感染4、8和16 h后，Western blot檢測細胞內HDAC的表達水平,結果顯示，細胞內HDAC1和HDAC2的表達水平均隨感染時間的延長顯著降低,見圖4A。酶活性實驗結果也顯示，NTHi感染8和16 h后，細胞內HDAC的酶活性均顯著降低(P<0.05)，見圖4B。進一步采用10 μg/L HDAC抑制劑TSA預處理后NTHi感染細胞,結果顯示，相較于未處理組，TSA預處理的細胞內IL-8分泌水平顯著上升(P<0.05)，見圖4C。

Figure 2.The effect of NF-κB signaling pathway on the secretion of IL-8 and GM-CSF. A: the expression of IκBα was detected by Western blot; B: the DNA binding activity of NF-κB was detected by EMSA; C: the mRNA expression of IL-8 and GM-CSF was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group;#P<0.05 24 h group．

圖2 NF-κB信號通路對IL-8與GM-CSF分泌的影響

Figure 3.NTHi induced phosphoacetylation of histones in BEAS-2B cells. A: the phosphoacetylation of histones H3 and H4 in the BEAS-2B cells was detected by Western blot; B: the binding activity of IL-8 and RNA polymerase Ⅱ was detected by chromatin immunoprecipitation.

圖3 NTHi誘導BEAS-2B細胞組蛋白磷酸乙酰化

討 論

NTHi作為廣泛存在于人體的條件致病菌，其可通過不同的機制入侵至呼吸道上皮細胞。而上皮細胞作為固有免疫的重要組成部分，其可通過促進趨化因子和炎癥因子的釋放，從而發揮致炎作用[8]。鑒于NTHi誘導上皮細胞炎癥反應的作用機制復雜，探究NTHi對呼吸道上皮細胞的致炎機制十分必要。

炎癥反應是NTHi發揮致病作用的關鍵，過度炎癥反應可使細胞產生毒性作用，并引發相關的病理反應導致炎性損傷[9]。本研究中，NTHi感染支氣管上皮細胞能顯著誘導炎癥因子IL-8和GM-CSF的分泌，提示細胞因子和趨化因子的分泌可能是NTHi所致炎癥反應的重要因素。而考慮到之前已有研究證實NTHi可通過MAPK誘導肺泡上皮細胞分泌炎癥因子IL-8[10]，本實驗結果也與之相符。

Figure 4.NTHi down-regulated the expression and activity of HDAC in BEAS-2B cells. A: the expression of HDAC1 and HDAC2 were detected by Western blot; B: the activity of HDAC in BEAS-2B cell was detected by enzyme activity assay; C: the le-vel of IL-8 was detected by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group;#P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsNTHi group.

圖4 NTHi下調BEAS-2B細胞內HDAC表達與活性

既往研究表明，NTHi在誘導上皮細胞分泌促炎因子分泌過程中受p38和ERK等通路調控[10]。但由于NTHi致炎機制較為復雜，因此必定還存在其他調控機制。本研究中，NTHi感染可顯著下調胞漿內總IκBα的表達，并顯著增強細胞內NF-κB的DNA結合活性，提示NF-κB信號通路被激活。而NF-κB抑制劑同樣能夠顯著降低細胞內GM-CSF和IL-8的表達水平，證實NF-κB參與了細胞因子的調控。而考慮到之前有研究證實NTHi可通過Toll樣受體2激活NF-κB通路誘導促炎因子IL-8的分泌[11]，本結果也進一步證實了該結論。

研究表明[12]，組蛋白乙酰化修飾能夠促進促炎相關基因的表達進而誘導炎癥反應。而在其它呼吸道致病菌感染的支氣管上皮細胞中，其組蛋白H3和H4的乙酰化水平也顯著增加[13]。本研究中NTHi感染的細胞內組蛋白H3和H4的磷酸乙酰化水平顯著提高，且IL-8和RNA 聚合酶II結合增加。Feng等[14]研究發現呼吸道合胞病毒感染支氣管上皮細胞可使H3發生去乙酰化，并最終引發氣道炎癥。同時他們也發現HDAC抑制劑能夠有效地逆轉組蛋白H3的去乙酰化，進而減輕炎癥反應。這也就可以解釋本研究結果：支氣管上皮細胞通過發生組蛋白乙酰化，進而促進炎癥相關分子與介質的表達。

本研究顯示，在NTHi感染的細胞內HDAC1和HDAC2的表達水平均隨感染時間的延長顯著下降，而酶活性也顯著降低。研究表明，HDAC可誘導乙酰化反應，進而抑制NF-κB信號通路的活化[15]，這可能是由于乙酰化可發生于NF-κB的不同賴氨酸位點[16]。這也可以解釋為什么NTHi可通過抑制NF-κB信號通路抑制組蛋白去乙酰化來促進上皮細胞炎癥。

綜上所述，本研究初步證實NTHi感染支氣管上皮細胞后能夠通過激活NF-κB信號通路抑制HDAC的表達活性，進而誘導IL-8和GM-CSF的分泌。但由于炎癥反應的調控機制復雜，NTHi誘導的炎癥反應是否還存在其它作用機制目前尚不清楚，仍有待進一步研究。