藍莓酒加工活性干酵母的篩選及發酵過程營養變化

張菊華，李高陽，許彎，胡小琴，胡梓妍，劉偉*

1. 湖南省農業科學院農產品加工研究所（長沙 410125）；2. 湖南大學研究生院隆平分院（長沙 410125）

藍莓是杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）多年生落葉或常綠灌木果樹。藍莓營養豐富，富含VC、花色苷、酚酸、類黃酮等，清除自由基能力很強，具有潛在的抗癌、抗衰老以及預防心臟病等保健功能[1-3]。目前藍莓的主要加工制品有果干、果汁和果酒等，其中藍莓酒加工屬于冷加工方式，是以藍莓或藍莓汁為原料（加糖或不加糖），經全部或部分發酵釀制而成的發酵酒[4]，可以較好地保留藍莓中的營養成分，發酵過程還產生新的風味物質和活性成分，成為藍莓加工的主導產品。

目前國內藍莓酒加工已有一些研究，如開展了藍莓果酒和藍莓浸泡酒的抗氧化及降血脂活性研究[5]；研究了發酵工藝對花色苷、類黃酮、有機酸、酚酸、香氣成分的影響[6-9]。酵母品種與酒的品質關系密切，有關藍莓酒的釀造酵母篩選研究較少，酵母菌不同會改變果酒成分，從而影響果酒的口感、風味及色澤等。郭成宇等[10]研究了2種酵母對藍莓酒的香氣成分差異；任春光等[11]開展了自然界藍莓果酒酵母篩選及發酵性能研究。此次試驗探討了四種葡萄酒酵母對藍莓汁的發酵能力、總酸及花色苷等的影響，并研究優良菌株發酵過程中主要營養成分的變化，旨在為藍莓酒的加工提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：成熟的粉藍（兔眼藍莓1號）果實；葡萄酒活性干酵母：Rhone、DV、BV、RV。

1.2 儀器、設備和試劑

1.2.1 儀器與設備

Oyoung（L18-Y929），九陽公司；電子天平（AL204），梅特勒-托利多；pH計（Mettler Toledo Delta 320），梅特勒-托利多；超凈工作臺（SWCJ-1B），蘇州凈化公司；智能恒溫恒濕培養箱（HWS），寧波江南儀器廠；紫外分光光度計（UV-1800），日本Shimadzu；高效液相色譜儀（LC-20AT）、PDA檢測器，日本Shimadzu；色譜柱，YMC-Pack Polyamine Ⅱ，250 mm×4.6 mm I.D。

1.2.2 試劑

蔗糖，食品級；果糖、葡萄糖、蔗糖標準品，美國Sigma公司；乙腈，色譜純，美國天地；乙酸、乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、亞硫酸等分析純，上海國藥集團；超純水（18 MΩ）Millipore Milli QRG超純水系統制備。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓制汁

冷凍藍莓解凍后打漿，加入0.2%果膠酶和0.1%纖維素酶，于50 ℃酶解1 h，再離心冷藏備用。

1.3.2 活性干酵母篩選

取4份藍莓汁，每份500 mL，調整藍莓汁總酸0.6%，按預設酒精度12%vol加入白砂糖，攪拌溶解，加入60 mg/kg SO2，放置過夜。

酵母活化：四種活性干酵母分別按0.05%接種量，分2次活化后使用。

發酵溫度控制24 ℃，發酵15 d測指標。

1.3.3 藍莓酒發酵過程樣本的制備

分別取6份藍莓汁，每份500 mL，調整藍莓汁總酸含量0.6%，按預設酒精度12%vol加入白砂糖，攪拌溶解，加入60 mg/kg SO2，放置過夜，按0.05%接種活化好的BV酵母，24 ℃控溫發酵，發酵0，2，4，6，9和20 d分別取樣，每個樣品分成3個平行凍藏，待主發酵完成后測定。

1.3.4 藍莓酒指標測定及方法

1.3.4.1 蔗糖、葡萄糖、果糖含量測定

量取1.0 mL藍莓酒，加少量超純水溶解，然后用超純水定容到20 mL，超聲處理30 min，用0.45 μm的針頭濾器過濾后進行HPLC分析。蔗糖、果糖、葡萄糖標準品濃度梯度為20，10，5，2.5和0.5 mg/mL，每個濃度重復3次。進樣體積20 μL，柱溫25 ℃，流速1.00 mL/min。流動相為乙腈-水（75︰25，V/V），每個樣品重復3次。果糖、葡萄糖、蔗糖標準曲線方程分別為Y=5.79×10-6X-2.35×10-2（R2=0.999），Y=7.37×10-6X-1.88×10-2（R2=0.999）和Y=5.51×10-6X-0.63（R2=0.998）。其標準品的高效液相色譜圖如圖1所示。

圖1 多糖混合標準品的高效液相色譜圖

1.3.4.2 總酸的測定

采用電位滴定法[12]測定。

1.3.4.3 酒精度的測定

采用酒精計法[12]測定。將收集到的餾出液在20 ℃的恒溫水浴鍋中恒溫20 min，接著倒入潔凈干燥的量筒，用酒精計測量讀數。

1.3.4.4 總花色苷含量的測定

采用的pH示差法[13]測定。

1.3.4.5 感官評價

藍莓酒的評分標準參照表1品評標準，得分由項目組成員品評后打分，取平均值。

表1 藍莓酒感官評分標準

1.3.5 數據處理

所有圖表繪制采用Origin 8和Excel 2003進行處理；利用SPSS 16.0進行顯著性分析，置信概率為0.95，p＜0.05為顯著差異。

2 結果與分析

2.1 不同葡萄酒活性干酵母的發酵能力分析

酵母菌無氧呼吸產生酒精和CO2，不同酵母菌發酵時產酒精能力和殘糖量都會有差異，如果初始含糖量相同，發酵結束后殘糖量低，說明酵母對糖的轉化利用率高，發酵能力強。

從表2可以看出，主發酵結束后，四株活性干酵母發酵藍莓酒中均有殘糖，蔗糖均未檢出，表明蔗糖經過酵母分泌的轉化酶已全部分解成己糖（果糖和葡萄糖）。Rhone菌株發酵酒中葡萄糖殘留量為4.95±0.85 g/L；果糖殘留量較高，為16.83±0.53 g/L，說明該菌株發酵果糖能力相對較弱。其余三株酵母殘留糖均為果糖，含量為2～4 g/L，發酵較徹底。

Rhone發酵酒的可溶性固形物（TSS）含量為8.8%±0.1%，TSS含量高于其余三種酵母，與藍莓發酵酒中殘留糖含量情況一致。產酒精度與殘糖情況相反，BV菌株的產酒精能力最強，酒精度為10.8%vol±0.1%vol，Rhone酵母產酒精度最低，為8.6%vol±0.4%vol。從殘糖、TSS及產酒精能力方面評價，發酵能力排序為BV＞DV＞RV＞Rhone，BV和DV酵母較適宜藍莓汁的發酵。

表2 不同活性干酵母發酵酒中殘糖及酒精度含量

2.2 不同葡萄酒活性干酵母發酵后總酸的變化

藍莓果實中有機酸主要以檸檬酸為主，占80%以上，其次為奎寧酸、蘋果酸和草酸，總酸含量最高可達25.14 mg/g鮮果[14]。適量的有機酸能增加酒的醇厚感和清爽感，但總酸含量過高會影響酵母的生長與發酵，將藍莓汁發酵前調整總酸含量為6.01±0.20 g/L。從圖2可以看出，四株菌發酵后的總酸有不同程度的升高，其中Rhone、BV、RV酵母發酵酒的總酸含量為6.5～7.0 g/L，酵母之間總酸差異不顯著，DV酵母發酵后總酸含量為8.25±0.18 g/L，顯著升高（p＜0.05）?？偹崤c果酒的風味有很大關系，果酒一般總酸量為5～8 g/L，Rhone、BV、RV酵母發酵產酸均在適宜的范圍內，需結合感官評定，選出最佳的口感及其相應的酵母。

2.3 不同葡萄酒活性干酵母對花色苷的影響

花青素對改善記憶有較好效果，Adrian等[15]研究表明采用急性富含類黃酮的藍莓飲品干預, 學齡兒童更能有效地編碼記憶項目?；ㄉ帐撬{莓酒中的一類重要化合物，與酒的品質密切相關，同時還與藍莓酒的抗氧化能力呈正相關關系[16], 因此藍莓酒加工中花色苷的保留具有重要意義。不同酵母發酵對花色苷保留能力不同，從圖3可以看出，BV菌株發酵酒的花色苷含量最高，為87.34±2.07 mg/L，與其他幾株相比有顯著性差異（p＜0.05），Rhone發酵酒的花色苷含量最低，DV和RV發酵酒的花色苷含量差異不顯著（p＞0.05）。從花色苷殘留量評價，BV酵母最優，DV酵母次之。

圖2 不同活性干酵母發酵后的總酸含量

圖3 不同活性干酵母發酵后的總花色苷含量

2.4 不同葡萄酒活性干酵母發酵藍莓酒的感官評價

感官指標是描述和判斷藍莓酒品質最直觀的指標，在一定主觀程度上對藍莓酒做出客觀分析的評價，能較好地反映藍莓酒的特征品質和質量要求。Rhone酵母發酵藍莓酒的得分相對較低，主要是相比其他酵母色澤偏淡、酒香及口感不足；DV和RV色澤相對較好，香氣較濃郁，果香、酒香較協調，酒體完整；BV色澤深紫紅、香氣口感均佳，具有藍莓酒的典型性，按表3的評分標準，感官評分為95分，BV為優選酵母，不同活性干酵母的感官評分雷達圖見圖4。綜合不同酵母的發酵特性，BV為適宜藍莓發酵的優良活性干酵母。

表3 藍莓酒感官評分

圖4 藍莓酒感官評分雷達圖

2.5 BV酵母發酵藍莓酒過程中蔗糖、葡萄糖及果糖的變化

酵母對蔗糖的吸收利用前，先將蔗糖水解成葡萄糖和果糖，后兩者再分別經過磷酸化進入糖酵解途徑。從圖5可以看出，藍莓汁發酵前蔗糖為98.76±1.94 g/L，發酵4 d后蔗糖快速下降至19.16±0.69 g/L，發酵6 d藍莓酒中的蔗糖已全部轉化成葡萄糖和果糖。葡萄糖發酵2 d減少緩慢，發酵4～9 d呈急劇下降趨勢，發酵20 d藍莓酒的葡萄糖未檢測出。果糖利用呈階段性下降趨勢，發酵前4 d保持穩定，果糖含量保持在72 g/L左右，發酵6 d快速降至57.60±1.18 g/L，發酵9 d的果糖與6 d水平一致，發酵20 d后果糖殘留量為3.36±0.21 g/L。葡萄糖和果糖下降趨勢表明：作為酵母可直接利用的單糖糖源，葡萄糖優先被酵母利用。

圖5 藍莓酒發酵過程中糖含量變化

2.6 BV酵母發酵藍莓酒過程總酸的變化

調整藍莓汁發酵初始總酸含量6.01±0.20 g/L，從圖6可以看出，總酸的總體趨勢為：發酵初期緩慢上升，發酵4～6 d總酸快速上升，發酵6 d的總酸含量最高，為7.5±0.16 g/L，發酵后期下降并逐漸穩定，主發酵結束時降至6.7±0.19 g/L。酵母發酵初期會產生乙酸、琥珀酸、蘋果酸、丙酮酸等[17]，導致藍莓酒總酸升高。發酵后期可能進行乳酸發酵，多元酸轉變成一元酸，使總酸又有所回落[18]；乙酸發酵期間部分被酵母還原成乙醇，蘋果酸也可能在適溫條件下被酵母降解[17]；同時部分酸與醇形成酯類物質，使得藍莓酒的總酸含量降低。發酵過程總酸變化情況表明BV酵母具有良好的降酸能力。

圖6 藍莓酒發酵過程中總酸含量變化

2.7 BV酵母發酵藍莓酒過程酒精度的變化

乙醇對酒的穩定性及感觀特征有重要意義，發酵過程中產生的乙醇抑制了大多數雜菌的生長，這種抑菌作用可保證低酸、無氧的果酒保存多年[17]。藍莓酒發酵初期，酵母利用糖類物質大量繁殖并產生少量酒精，發酵2～9 d過程中，藍莓酒的酒精度快速增加至8.4%vol±0.3%vol；至發酵中后期（10～20 d），酵母發酵的速率降低，殘糖量減少，且藍莓酒中的酒精會對酵母產生一定的抑制作用，使酒精度增長緩慢，主發酵20 d酒精度達到11.5%vol±0.2%vol，基本達到預設酒度。

圖7 藍莓酒發酵過程中酒精度變化

2.8 BV酵母發酵藍莓酒過程總花色苷的變化

花色苷是一種易降解的類黃酮物質，它的穩定性易受到多種因素的影響[19]?；ㄇ嗨貥O不穩定, 花青素首先降解形成查耳酮, 之后繼續降解, 形成如間苯三酚醛和原兒茶酸化合物[20], 降解影響其生物活性。如圖8所示，藍莓汁未發酵時的花色苷含量最高，達到279.87±3.32 mg/L，發酵9 d后降至153.46±2.39 mg/L，發酵20 d后花色苷含量為56.28±3.57 mg/L，藍莓酒中的花色苷呈現持續減少的趨勢，與劉慧等[6]的研究結果一致。酵母開始發酵后，花色苷在酸、氧、光、熱等共同因素作用下而分解，同時由于部分酵母自溶產生的酵母泥、果皮吸附部分花色苷，從而使花色苷在主發酵期間出現快速減少現象[18,21]。

圖8 藍莓酒發酵過程中總花色苷含量變化

3 結論與討論

活性干酵母具有易于保藏、發酵迅速、品質穩定、使用方便等特點，在果酒加工中得到廣泛應用。酵母菌種是果酒發酵最關鍵的因素，同一原料采用不同菌種，果酒的品質差別較大。陳趕林等[22]采用7種活性干酵母發酵蓮霧果汁，篩選出最適的Lalvin 71B降酸干酵母，其發酵的蓮霧果酒色、香、味俱佳。劉國明等[23]根據發酵效率和感官評分結果，從10種釀酒酵母中篩選出適宜荔枝發酵的菌種Lalvin EC1118。此次試驗選擇四種葡萄酒活性干酵母應用于藍莓酒的發酵研究，旨在篩選一種適合藍莓發酵的優良酵母，為藍莓酒的加工提供參考。結果表明，BV酵母的發酵能力較強，發酵酒的總花色苷含量高達87.34±2.07 mg/L，感官評分95分，適宜于藍莓酒發酵。對BV酵母發酵過程中糖組分、酒精度、總酸、總花色苷等營養成分變化規律進行研究，進一步明確了BV酵母加工藍莓酒的發酵特性，對于BV酵母的生理生化特性及應用于藍莓酒的發酵工藝還有待于進一步研究。此次試驗為藍莓酒的工業化生產提供理論依據和技術指導。