草魚(yú)兩個(gè)細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3基因序列及表達(dá)分析

趙姍姍 孫 源 鄭國(guó)棟 陳 杰 鄒曙明

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部團(tuán)頭魴遺傳育種中心, 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種植資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306)

在脊椎動(dòng)物中, 細(xì)胞因子在包括體內(nèi)平衡和免疫反應(yīng)在內(nèi)的許多生理過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。細(xì)胞因子之間的相互作用與細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子密切相關(guān), 許多細(xì)胞因子通過(guò)JAK/STAT途徑發(fā)揮作用[1,2]。細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子(SOCS)蛋白通過(guò)調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路, 最終達(dá)到調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)的目的[3]。SOCS家族的所有成員(SOCS1-7和CIS)皆由N-端結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域和SOCS盒子構(gòu)成[4], 而在SOCS家族的成員中只有SOCS1和SOCS3在N端區(qū)域有激酶抑制區(qū)域, 激酶抑制區(qū)域可以作為JAKs的偽底物。

SOCS3作為SOCS蛋白家族新發(fā)現(xiàn)的一員, 人們發(fā)現(xiàn)SOCS3可被多種免疫細(xì)胞因子誘導(dǎo), 如白細(xì)胞介素(IL)等[5]。近年來(lái), SOCS3已經(jīng)在青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)、斑馬魚(yú)(Danio rerio)、紅旗東方鲀(Fugu rubripes)、三刺魚(yú)(Gasterosteus aculeatus)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、鯉(Cyprinus carpio)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、草魚(yú)(Ctenopharyn-godon idellus)等魚(yú)種中被發(fā)現(xiàn)[6—11]。在魚(yú)類(lèi)中鑒定出的所有SOCS家族成員都應(yīng)該是由特定的魚(yú)類(lèi)基因復(fù)制事件引起的[12,13]。有研究表明, SOCS3是許多生物過(guò)程的關(guān)鍵影響因素, 包括免疫反應(yīng)和細(xì)胞存活等[14,15]。目前魚(yú)類(lèi)SOCS3的兩個(gè)拷貝基因在表達(dá)水平上比較分析只有少數(shù)的研究。

草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)作為一種主要的食草性淡水魚(yú), 因其味道鮮美在中國(guó)廣受歡迎。2017年, 我國(guó)草魚(yú)產(chǎn)量達(dá)到5.35×109kg[16]。在本研究中, 我們從草魚(yú)中克隆了SOCS3b, 確定了成體組織中SOCS3a和SOCS3b表達(dá)模式。此外, 研究了注射嗜水氣單胞菌后草魚(yú)SOCS3s基因的表達(dá)情況。本研究將為后續(xù)草魚(yú)SOCS3s基因的功能研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究中所有的實(shí)驗(yàn)都是按照上海海洋大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和護(hù)理委員會(huì)批準(zhǔn)的指導(dǎo)方針進(jìn)行的。本研究中草魚(yú)取自上海海洋大學(xué)濱?；亍１緦?shí)驗(yàn)中所有草魚(yú)取組織前都先用100 mg/L的MS-222(三卡因甲磺酸鹽, Sigma)處理?？焖偃〔蒴~(yú)成魚(yú)組織, 包括腦、眼、鰓、心、肝、脾、腸、腎、皮、肌和性腺, 儲(chǔ)存在-80℃冰箱中。

1.2 草魚(yú)SOCS3b基因的克隆

按照說(shuō)明書(shū)要求, 總RNA提取試劑盒(Promega)提取草魚(yú)總RNA, 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(GoScriptTMReverse Transcription System. Promega)得到第一鏈cDNA。實(shí)驗(yàn)室克隆得到的團(tuán)頭魴SOCS3b基因(GenBank Acc. No. MH107242)為模板, 設(shè)計(jì)引物對(duì)F1/R1(表 1)擴(kuò)增草魚(yú)SOCS3bcDNA片段一, 然后設(shè)計(jì)引物對(duì)F2/R2(表 1)擴(kuò)增草魚(yú)SOCS3bcDNA片段二。經(jīng)過(guò)測(cè)序結(jié)果整合后, 總擴(kuò)增出1398 bp cDNA片段, 用于設(shè)計(jì)基因特異性引物3′RACE(3RACE-O, 3RACE-I)和5′RACE(5RACE-O, 5RACE-I)。5′和3′RACE使用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)處理后進(jìn)行測(cè)序, 具體操作參考杜尚可[17]。測(cè)序結(jié)果用BioEdit 7.0.0.1軟件, 拼接得到草魚(yú)SOCS3b基因cDNA全長(zhǎng)序列。

1.3 嗜水氣單胞菌攻毒實(shí)驗(yàn)

健康草魚(yú)幼魚(yú)(23±4) g在室內(nèi)水泥池飼養(yǎng)2周。從病魚(yú)中提取的致病性嗜水氣單胞菌, 接種到LB液體培養(yǎng)基中, 搖床28℃培養(yǎng)16h。細(xì)菌的濃度即每毫升菌液的菌落數(shù)(CFU/mL)通過(guò)使用平板計(jì)數(shù)法獲得。離心收集嗜水氣單胞菌, 制備成4×106CFU/mL磷酸鹽(PBS, 上海生工生物技術(shù)公司)菌懸液。實(shí)驗(yàn)組感染18條幼魚(yú), 腹腔注射0.1 mL上述PBS菌懸液, 對(duì)照組對(duì)18條幼魚(yú)注射0.1 mL PBS溶液。注射后的草魚(yú)放回水泥池, 水溫維持在28℃左右。注射后0、2h、4h、8h、12h和24h, 隨機(jī)抽取兩組各3條魚(yú)進(jìn)行麻醉, 取其肝、脾、腸和腎超低溫保存。

1.4 序列及進(jìn)化樹(shù)分析

使用BioEdit 7.0.0.1分析SOCS3a和SOCS3bcDNA的核苷酸序列[18]。通過(guò)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)ORF Finder在線(xiàn)查找開(kāi)放閱讀框,BLASP和Search程序?qū)Σ煌锓N的SOCS3蛋白推測(cè)序列進(jìn)行比較[17]。Compute pI/Mw(http://web.expasy.org/compute_pi)預(yù)測(cè)蛋白分子量和等電點(diǎn)。Phyre2和Pymol軟件預(yù)測(cè)SOCS3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[19]。MEGA 6.06[20]構(gòu)建SOCS3系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析

實(shí)時(shí)定量PCR在CFX96 TouchTMreal-time PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad)中進(jìn)行[21]。以18S(引物對(duì)為18S-F/-R)為對(duì)照[22], 使用SYBR Green Premix ExTaq(TaKaRa)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。數(shù)據(jù)以Mean±SE的形式表示, 用SPSS Statistics 17.0軟件采用單因素方差法分析。

2 結(jié)果

2.1 草魚(yú)SOCS3b cDNA序列

本文克隆的到的草魚(yú)SOCS3b基因序列已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù), 基因庫(kù)編號(hào)MH463452。草魚(yú)SOCS3b基因全長(zhǎng)2126 bp, 5′非編碼區(qū)長(zhǎng)170 bp, 開(kāi)放閱讀框?yàn)?51 bp, 3′非編碼區(qū)長(zhǎng)1307 bp。分析得到該序列編碼216個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為7.15, 相對(duì)分子質(zhì)量為23.90 kD。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)草魚(yú)SOCS3(GenBank Accession No. EU625352.1)經(jīng)序列對(duì)比,與斑馬魚(yú)SOCS3a(NM199950.1)相似度為87%, 與團(tuán)頭魴SOCS3a(MH107241)相似度99%, 我們判斷它與斑馬魚(yú)和團(tuán)頭魴SOCS3a直系同源(Orthologue)。為了方便區(qū)分, 本文中將上述草魚(yú)SOCS3在稱(chēng)為草魚(yú)SOCS3a。序列分析草魚(yú)SOCS3b包含一個(gè)SH2域和一個(gè)SOCS盒, 與草魚(yú)SOCS3a和其他物種SOCS3相似。通過(guò) Phyre2 程序和 Pymol 軟件預(yù)測(cè)草魚(yú)SOCS3b二級(jí)結(jié)構(gòu), 并與人類(lèi)(Homo sapiens)SOCS3、斑馬魚(yú)SOCS3s和草魚(yú)SOCS3a對(duì)比, 發(fā)現(xiàn)人類(lèi)、斑馬魚(yú)與草魚(yú)SOCS3二級(jí)結(jié)構(gòu)都主要包括α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲(圖 1), 且結(jié)構(gòu)相似。

通過(guò)NCBI BLASP發(fā)現(xiàn),SOCS3a和SOCS3b基因都廣泛存在于硬骨魚(yú)中, 包括鯉科、異鳉科、棘魚(yú)科和副棘魚(yú)科。BioEdit 7.0.0.1分析得出, 草魚(yú)SOCS3a和SOCS3b的成熟肽具有72%相似度,SOCS3a的SH2結(jié)構(gòu)域和SOCS盒分別與SOCS3b序列相似度分別為76%和78%。草魚(yú)SOCS3a/3b和人SOCS3的氨基酸序列相似度分別為63%和62%。草魚(yú)和斑馬魚(yú)SOCS3a氨基酸序列相似度(87%)低于草魚(yú)和斑馬魚(yú)SOCS3b氨基酸相似度(91%)。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明草魚(yú)SOCS3a和SOCS3b與其他硬骨魚(yú)種的直系同源體均有良好的聚類(lèi)關(guān)系(圖 2)。草魚(yú)SOCS3a和SOCS3b的成熟肽相似度(72%), 小于草魚(yú)和斑馬魚(yú)SOCS3a氨基酸序列相似度(87%), 也小于草魚(yú)和斑馬魚(yú)SOCS3b氨基酸相似度(91%)。因此所有魚(yú)類(lèi)SOCS3a聚類(lèi)為一簇, 而所有SOCS3b聚類(lèi)為一簇。

2.2 SOCS3a和SOCS3b的表達(dá)模式

通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)到SOCS3a和SOCS3b在草魚(yú)成魚(yú)11個(gè)組織中均有所表達(dá), 但表達(dá)略有不同。草魚(yú)SOCS3a在鰓、脾、腸、肝、肌、腎和皮中表達(dá)較高, 在心、腦、眼和性中表達(dá)較低(圖 3);SOCS3b在鰓、肝、脾、腸、性、皮和腎中表達(dá)較高, 在肌、心、腦和眼中表達(dá)較低(圖 3)。

圖 1 預(yù)測(cè)人類(lèi)、斑馬魚(yú)及草魚(yú)SOCS3二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 1 The predicted the secondary structure of SOCS3 in human, zebrafish and grass carp

圖 2 草魚(yú)SOCS3s基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of grass carp SOCS3s sequences in vertebrates

2.3 嗜水氣單胞菌處理后草魚(yú)組織中SOCS3s的表達(dá)

為了研究注射嗜水氣單胞菌后草魚(yú)中SOCS3a和SOCS3b的表達(dá)模式, 在草魚(yú)幼魚(yú)腹腔內(nèi)注射相同劑量的嗜水氣單胞菌[23]。在目前的研究中, 注射嗜水氣單胞菌后SOCS3a和SOCS3b在肝臟、脾、腸和腎臟組織的表達(dá)顯著(P＜0.01, 圖 4)。經(jīng)qRTPCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn), 與對(duì)照組相比, 肝臟中SOCS3a/3bmRNAs表達(dá)峰值出現(xiàn)在注射后2h(2 hpi), 分別為對(duì)照組的21.6倍和17.5倍, 然后表達(dá)量幾乎減少到原始水平; 在脾臟中,SOCS3a/-3bmRNAs表達(dá)峰值出現(xiàn)在4 hpi(17.6倍和18.8倍), 然后幾乎下降到原始水平; 在腸道中,SOCS3a和SOCS3b最高表達(dá)量出現(xiàn)在4 hpi(分別為21.4倍和16.1倍);SOCS3a/3bmRNAs在腎臟中的相對(duì)表達(dá)量在12 hpi時(shí)達(dá)到峰值, 與對(duì)照組相比分別約29.6倍和22.2倍(圖 4)。

3 討論

3.1 草魚(yú)SOCS3b序列分析

哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)和兩棲動(dòng)物SOCS3只有一個(gè)拷貝, 現(xiàn)發(fā)現(xiàn)硬骨魚(yú)中SOCS3有兩個(gè)拷貝[24]。在本研究中, 我們?cè)诓蒴~(yú)中克隆了SOCS3b基因。草魚(yú)SOCS3a和SOCS3b的成熟肽區(qū)域中均含有脊椎動(dòng)物中保守表達(dá)的SH2結(jié)構(gòu)域、SOCS盒子以及N端分泌信號(hào), 預(yù)測(cè)的草魚(yú)SOCS3b二級(jí)結(jié)構(gòu)圖與人類(lèi)、斑馬魚(yú)和草魚(yú)SOCS3相似, 說(shuō)明草魚(yú)SOCS3s基因在長(zhǎng)期進(jìn)化中高度保守。通過(guò)對(duì)氨基酸半胱氨酸殘基的觀察, 發(fā)現(xiàn)SOCS3b分子中還含有除團(tuán)頭魴外與其他魚(yú)類(lèi)不同的半胱氨酸殘基(Cys-105)。這表明草魚(yú)和團(tuán)頭魴SOCS3b結(jié)構(gòu)的特殊性,可能與其他魚(yú)類(lèi)SOCS3b有略微不同。

草魚(yú)SOCS3a和SOCS3b成熟肽相似度為72%,這與斑馬魚(yú)SOCS3a和SOCS3b相似度(68%)相似。草魚(yú)SOCS3a/-3b氨基酸序列和斑馬魚(yú)SOCS3a/-3b相似度分別為87%和92%, 說(shuō)明草魚(yú)SOCS3s與斑馬魚(yú)SOCS3s同源性高。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明, 草魚(yú)SOCS3a和SOCS3b與其他硬骨魚(yú)種的直系同源體均有良好的聚類(lèi)關(guān)系, 這表明它們是硬骨魚(yú)特異性基因組復(fù)制的結(jié)果。

3.2 草魚(yú)SOCS3s表達(dá)模式分析

研究部分硬骨魚(yú)發(fā)現(xiàn),SOCS3在成體組織中表達(dá)[8]。同樣, 草魚(yú)SOCS3a和SOCS3b都在成體組織中表達(dá)。我們檢測(cè)到性腺中SOCS3b表達(dá)量高, 而SOCS3a表達(dá)量低, 說(shuō)明這兩個(gè)基因表達(dá)有不同之處。此外, qRT-PCR檢測(cè)到草魚(yú)SOCS3s基因在鰓、肝、脾、腎、腸、皮膚等免疫相關(guān)組織中高度表達(dá)。先前研究報(bào)道虹鱒SOCS3在脾、腸、鰓和皮中大量表達(dá)[7], 大菱鲆SOCS3在鰓、脾、肝、腎中大量表達(dá)[9], 鯉SOCS3在鰓、頭腎、皮和脾中大量表達(dá)[8], 說(shuō)明本研究結(jié)果與前人的一致。根據(jù)這些表達(dá)特征可以推斷草魚(yú)SOCS3s基因可能與免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)。

圖 3 草魚(yú)SOCS3s在成體不同組織的表達(dá)情況Fig. 3 The SOCS3s mRNA levels in adult tissues of grass carp

3.3 嗜水氣單胞菌處理后草魚(yú)組織中SOCS3s表達(dá)分析

近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明, SOCS3與免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)。在我們的研究中, 嗜水氣單胞菌感染草魚(yú)后, 肝、脾、腸和腎中SOCS3s的表達(dá)量首先顯著增加, 然后幾乎下降到原來(lái)的水平。我們的研究結(jié)果與前人的相似, 有研究報(bào)道LPS(脂多糖)注射到河豚后, 脾和肝的SOCS3表達(dá)水平顯著升高[6];鯉感染SVCV(鯉病毒春季病毒血癥)后, 脾、腸和腎組織的SOCS3表達(dá)模式在感染后顯著升高, 隨后幾乎下降到正常水平[8]。大菱鲆感染魚(yú)源鰻線(xiàn)蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)中, 隨著時(shí)間的變化誘導(dǎo)腎臟、脾臟和肝臟中的SOCS3 mRNA的轉(zhuǎn)錄[9]。我們的結(jié)果表明草魚(yú)SOCS3s與草魚(yú)的免疫反應(yīng)相關(guān), 似乎引發(fā)了草魚(yú)對(duì)嗜水氣單胞菌的炎癥反應(yīng), 這表明魚(yú)類(lèi)中的SOCS3s也可能在平衡細(xì)胞因子利害關(guān)系中發(fā)揮著重要作用。我們的研究和前人的報(bào)道都表明硬骨魚(yú)SOCS3s可能在調(diào)節(jié)細(xì)菌誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮積極的作用。

圖 4 嗜水氣單胞菌處理后幼魚(yú)各組織中草魚(yú)SOCS3的表達(dá)情況Fig. 4 The SOCS3 mRNA level in juvenile tissues after Aeromonas hydrophila injection of grass carp

綜上所述, 我們克隆了草魚(yú)的SOCS3b基因。序列和表達(dá)結(jié)果表明, 草魚(yú)的兩個(gè)SOCS3基因應(yīng)該是由一個(gè)祖先基因進(jìn)化而來(lái)。據(jù)檢測(cè), 草魚(yú)SOCS3s基因在鰓、肝、脾、腎、腸、皮膚等免疫相關(guān)組織中高度表達(dá)。經(jīng)過(guò)嗜水氣單胞菌處理后, 各免疫相關(guān)組織中SOCS3s可以被誘導(dǎo)表達(dá)升高, 然后幾乎降低到正常水平。本研究將為后續(xù)草魚(yú)SOCS3s基因的功能研究提供相關(guān)參考依據(jù), 為參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號(hào)傳遞和硬骨魚(yú)的細(xì)菌防御的SOCS3s機(jī)制的研究提供新的線(xiàn)索。