卵形鯧鲹組織蛋白酶B基因的克隆及表達分析

朱 鵬 胡 舒 喬瑞峰 廖永巖 王姝懿 彭金霞 陸專靈 韋友傳

(1. 北部灣大學海洋學院, 廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室, 欽州 535011; 2. 廣西大學動物科學技術學院,南寧 530004; 3. 廣西水產科學研究院廣西水產遺傳育種與健康養殖重點實驗室, 南寧 530021)

組織蛋白酶B(Cathepsin B, CatB)屬于組織蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶, 以酶活性中心具有Cys-His雙氨基酸基團為主要分子特征[1,2]。機體中的樹突狀細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞表面的主要組織相容性復合體Ⅱ(Major Histocompatibility Complex, MHCⅡ)通過抗原遞呈作用, 將抗原信息傳遞給B細胞, 從而產生特異性抗體, 發揮免疫功能。CatB可降解MHCⅡ恒定鏈(Invariant chain), 促進MHCⅡ成熟, 調節抗原遞呈作用[3]。此外,CatB還參與抗原降解[4]、細胞凋亡[5]、腫瘤的發生與轉移[6]等多種生理活動。成熟的CatB由無活性的前體酶原(Preprocathepsin)水解產生, 空間結構包含L型域和R型域, 兩者向內延伸形成V型活性中心[7]。與其他組織蛋白酶比較, CatB缺乏高度保守的ERFNIN基序[8], 且CatB具有雙切酶特性, 在正常生理情況下CatB在溶酶體內參與蛋白質的降解過程, 其活性位點是閉合環狀結構, 表現活性為外切酶活性[9];在病理條件下, CatB參與的生理過程位于溶酶體外, 閉合環狀打開后表現為內切酶活性[10]。

目前,CatB基因已在人(Homo sapiens)[11]、小鼠(Mus musculus)[12]等哺乳動物和魚類的斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)[13]、條石鯛(Oplegnathusfasciatus)[14]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[15]、建鯉(Cyprinus Carpiovar Jian)[16]、斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)[17]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[18]、大黃魚(Pseudosciaena crocea)[3]中得到克隆鑒定, 這些成果為卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)CatB(TroCatB)研究提供科學參考。卵形鯧鲹是我國華南沿海地區重要的海水養殖經濟魚類。隨著養殖規模的擴大, 由溶藻弧菌等病原感染引起的傳染性疾病不時發生, 給廣西沿海地區卵形鯧鲹的養殖業造成嚴重危害, 造成巨大的經濟損失[19—21]。因此, 有必要開展卵形鯧鲹免疫相關基因的研究, 以期為卵形鯧鲹的病害防控提供理論支撐。迄今, 未見關于TroCatB基因的研究報道。本實驗室在完成TroCatL的研究基礎上[22], 本次研究應用RT-PCR和RACE技術克隆TroCatB基因全長cDNA, 利用生物信息學方法進行分子結構和進化分析, 建立實時熒光定量PCR(Realtime quantitative PCR, qPCR)方法, 檢測TroCatB基因在健康組織中的表達情況以及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染后其mRNA的表達變化, 為進一步研究TroCatB在免疫過程中的功能以及其對病原的抗病機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物處理與菌株

實驗所用的卵形鯧鲹[體重(225.47±15.28) g],共55尾, 來源于北海市鐵山港區石頭埠豐順養殖有限公司, 挑選健康活力強的個體暫養于實驗室循環海水水族箱內, 鹽度20‰—30‰, 水溫25—27℃、pH 7—8.1, 溶解氧5 mg/L以上, 24h連續充氣。實驗前暫養7d, 每天投喂卵形鯧鲹商品飼料1次。感染用溶藻弧菌菌株由本實驗室從患病卵形鯧鲹中分離鑒定, 回歸感染確定具有致病性。

1.2 TroCatB基因cDNA全長克隆與序列分析

總RNA的提取和RT-PCR根據TRIzol?Reagents(Invitrogen, USA)試劑產品使用手冊提取卵形鯧鲹脾臟的總RNA。參照RT-PCR試劑盒說明書, 合成卵形鯧鲹cDNA第一鏈: 反應體系為20 μL,總RNA模板為2 μg, 所得cDNA放入-80℃冰箱中保存備用。參照NCBI網站上已知的深裂眶鋸雀鯛(Stegastes partitus; GenBank: XM008300468)、斜帶石斑魚(GenBank: KC832926)和大黃魚(GenBank:XM010732314)的CatB基因氨基酸序列比對結果,進而設計出TroCatB的巢式PCR兼并引物(表 1), 引物由上海生工生物有限公司合成。

表 1 本文所用引物的核苷酸序列Tab. 1 Nucleotide sequences of primers used in this paper

TroCatB基因cDNA中間片段擴增cDNA第一鏈作為模板, 運用巢氏PCR技術獲取TroCatBcDNA的中間片段, PCR反應體系及程序為: 第一輪PCR反應體系: cDNA模板1 μL, 10 ×buffer 2.5 μL,dNTP mix(10 mmol/L)0.25 μL, 上下游引物各1 μL(表 1, 上游為TroCatBF1/下游為TroCatBR1),Taq酶1 μL, 加ddH2O至終體積25 μL。第二輪PCR反應以第一輪PCR產物稀釋50倍后作為模板,反應體系中僅把模板和引物替換, 分別為TroCatBF2/R2(表 1), 以同樣的反應程序進行PCR擴增。程序都為: 94℃ 4min; 94℃ 30s, 65℃ 30s, 72℃ 60s(5 cycles); 94℃ 30s, 63℃ 30s, 72℃ 60s(5cycles); 94℃30s, 61℃ 30s, 72℃ 60s(20 cycles); 72℃延伸10min。PCR產物純化后與pMD-18T載體(TaKaRa)連接,轉化大腸桿菌TOP10, 陽性克隆送上海生工公司測序。

TroCatB基因cDNA末端擴增根據中間片段測序結果, 設計RACE-PCR引物(表 1)。參照SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明書, 制備卵形鯧鲹5′和3′ SMART cDNA第一鏈。獲取5′末端的反應體系中, 第一輪PCR反應以卵形鯧鲹5′ SMART cDNA 1 μL為模板, 加入5′末端外引物TroCatB-5R1、UPM(表 1)各1 μL,Taq酶1 μL, 加水至終體積25 μL。PCR反應條件同中間片段的擴增條件。第二輪PCR反應以第一輪PCR產物稀釋50倍后作為模板, 引物為TroCatB5R2和NUP(表 1),其他同第一輪。同理, 獲取TroCatB基因的3′末端。5′和3′ RACE第二輪擴增產物的處理與中間片段相同。

TroCatB基因cDNA序列生物信息學分析采用SeqMan軟件拼接TroCatB基因cDNA全長序列;ExPASy網站(http://expasy.org/tool)的在線軟件分析TroCatB基因的開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)、蛋白分子量及其推導的氨基酸序列; 使用MegAlign、Signal4.1、SWISS-MODEL、MEGA5.0等軟件分別進行TroCatB蛋白的同源性分析、信號肽預測、蛋白三級結構預測及構建N-J系統發育樹(Neighbor-Joining tree)(設定bootstraps為1000)。

1.3 卵形鯧鲹的細菌感染處理及qPCR檢測

實驗用健康卵形鯧鲹飼養7d后, 取5尾麻醉, 分離腦、鰓、胃、腸、頭腎、肝臟、心臟、脾臟、肌肉組織樣品, 用于檢測TroCatB在健康魚體各組織的表達分布, 另外50尾卵形鯧鲹平均分為實驗組和對照組。實驗組每條腹腔注射0.1 mL濃度為1×107cfu/mL溶藻弧菌, 對照組注射等量滅菌的PBS。于注射后不同時間點(0、6h、12h、24h、48h)每次麻醉5條, 分別采集頭腎、脾臟樣品。所采集的樣品放入液氮中凍存, 用于分析溶藻弧菌感染與TroCatB基因表達的關聯性。

根據TroCatB基因全長序列設計qPCR引物, 以β-actin為內參, 引物分別標記為QCatB-F1/QCatBR1和β-actinF1/β-actinR1(表 1)。使用LightCycler?96(Roche)進行實時熒光定量PCR反應, PCR反應體系(20 μL)包含2 μL cDNA模板, 7.4 μL的H2O, 10 μL SYBR?Green PreMix ExTaqTMⅡ(TaKaRa), 上下游引物各0.3 μL。反應條件: 95℃ 3min; 94℃ 30s,64℃ 20s, 72℃ 20s(40 cycles), 每次延伸后熒光讀板;72℃延伸3min。每個樣品均重復3次。相對定量計算方法參照Pfaffl法[23]。

2 結果

2.1 TroCatB基因cDNA全長序列特征分析

測序結果顯示, 5′端、中間片段和3′端的長度分別為961、591和783 bp。用SeqMan軟件拼接得TroCatB基因cDNA全長為2181 bp(GenBank登錄號:MK140677), 包括993 bp的ORF, 5′端和3′端非編碼區(UTR)分別為391和797 bp, 3′端有poly(A)尾。TroCatB蛋白信號肽預測顯示, 其信號肽序列位于氨基酸序列的的第1—18位, 序列為MWRAAFLL LAAGLSVSLA。氨基酸序列分析表明,TroCatB基因推定編碼330個氨基酸殘基, 理論等電點(pI)為5.73, 預測分子質量為36.37 kD, 存在半胱氨酸蛋白酶家族均有的前體結構域propeptide-C1(圖 1,25—64 aa)、成熟肽區(79—328 aa)。還發現1個谷氨酰胺氧陰離子洞(101Gln)和半胱氨酸(107Cys)、組氨酸(277His)、天冬氨酸(297Asn)3個蛋白酶催化位點(圖 1)以及三個蛋白酶活性區域: Cys活性區域(QGSCGSCWAFGA), His活性區(GGHAIKVLGWG),Asn活性區域(YWLCANSWNTDWGDNGYFKI)。兩個N-糖基化結合位點(NTTW、NGSR)和決定CatB外切酶活性的閉合環狀結構179Pro-199Glu)也被鑒定存在其中。

圖 1 TroCatB蛋白三級結構預測Fig. 1 SWISS-MODEL tertiary structure simulation of TroCatB protein

2.2 TroCatB氨基酸序列的同源性及進化分析

將TroCatB與其他30個物種的同源基因的氨基酸序列進行同源性比對, 結果顯示:TroCatB基因氨基酸序列與哺乳類的同源性在68.8%—72.2%, 與鳥類的同源性為69.4%—72.5%, 與爬行類的同源性最高為68.6%, 最低為67%, 與兩棲類中的熱帶爪蟾的同源性為69.2%。與其他魚類的同源性在78.8%—90.9%, 其中同源性最高的是髙體(Seriola dumerili, 90.9%), 最低的是北極紅點鮭(Salvelinus alpinus,78.8%)。數據顯示, 不同物種的peptidase-C1A-cathapsinB結構域(成熟肽區)的同源性普遍都在70%以上;TroCatB與其他魚類的peptidase-C1A-cathapsinB結構域的同源性在80.0%—92.4%, 且與高體的同源性最高。鄰近法構建NJ系統發育樹發現(圖 2), 進化樹共分為哺乳類、鳥類、爬行類、兩棲類和魚類五枝, 其中卵形鯧鲹與其他魚類聚為一枝, 并與鱸形目的高體距離最近, 表明卵形鯧鲹與其他魚類的聚類, 并具有很高Bootstrap值。

圖 2 基于CatB氨基酸序列構建的系統發育進化樹Fig. 2 Phylogenetic analysis of CatB amino acid sequence between Trachinotus ovatus and other species

2.3 TroCatB基因mRNA的組織表達水平分析結果

qPCR技術檢測TroCatB基因mRNA在正常卵形鯧鲹各組織的表達水平(圖 3)。結果顯示,TroCatB基因在健康卵形鯧鲹的9個組織中均有表達, 且呈組成型分布。其中TroCatB在免疫器官脾臟中表達水平最高, 頭腎、鰓、腸相對較高, 肌肉和腦組織中相對較低, 在心臟組織中表達水平最低。相對定量數據以心臟組織表達水平(設定為1)作為參照進行計算。

2.4 溶藻弧菌刺激后TroCatB基因mRNA的表達規律

溶藻弧菌刺激處理0、6h、12h、24h、48h后,實驗組和對照組qPCR檢測結果顯示: 實驗組TroCatBmRNA在脾臟、頭腎組織中的表達水平較對照組均顯著上調(*P＜0.05, **P＜0.01), 脾臟中的mRNA表達水平于6h達到最高值100.94倍, 頭腎中mRNA表達量在刺激后12h達到最高水平。此后,相對于最高水平出現下降趨勢, 但表達仍高于0時的正常表達水平(圖 4)。

圖 3 TroCatB基因mRNA在健康卵形鯧鲹各組織的相對表達水平Fig. 3 The relative expression of TroCatB mRNA in different tissues of healthy Trachinotus ovatus

圖 4 溶藻弧菌刺激后TroCatB基因mRNA的表達變化Fig. 4 The TroCatB mRNA level post Vibrio anguillarum infection

3 討論

3.1 CatB基因cDNA全長的克隆及生物信息學分析

CatB是半胱氨酸蛋白酶家族的典型代表, 在機體的免疫系統中發揮著重要作用。本研究克隆獲得了TroCatB基因cDNA全長序列, 為2181 bp, 預測編碼330個氨基酸的前體蛋白酶原, 其中含有18個氨基酸殘基的信號肽、40個氨基酸殘基的前體肽和249個氨基酸殘基的成熟肽, 這些結果與已知的凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[24]、太平洋鮑(Haliotis discus hannai)[25]、大菱鲆[18]等CatB基因的研究結果類似。此外,TroCatB具有半胱氨酸蛋白酶家族共有的三個蛋白酶催化活性位點, 分別為半胱氨酸(107Cys)、組氨酸(277His)、天冬氨酸(297Asn),這與之前報道吻合[24]; 它們在催化位點的形成、穩定和蛋白酶三級結構的構建中起關鍵的作用[26,27],同樣的結果在斑點叉尾鮰[17]、大菱鲆[18]、太平洋鮑[25]等的研究中也有出現, 但其氨基酸的序列位置不盡相同, 這可能是不同物種間的差異所致。CatB的三維結構較其他組織蛋白酶多含一個具有外切酶的活性的閉合環狀結構, 這是CatB的典型特征; 此次研究中,TroCatB中也存在這樣的結構, 這與之前關于大菱鲆[18]、大黃魚[3]CatB的報道相似;不僅魚類如此, 淡水貽貝(Cristaria plicata)[28]、太平洋鮑[26]等貝類的CatB結構中也含有此結構, 表明此結構在物種進化過程中相當保守, 是CatB的一個重要的功能結構域。

同源性及進化分析顯示,TroCatB推定的氨基酸序列與其他魚類的CatB氨基酸序列有較高的同源性(78.8%—90.9%), 表明TroCatB基因與條石鯛[14]等魚類的CatB基因相似度高。將TroCatB的成熟肽與其他脊椎動物的成熟肽(peptidase-C1A-cathapsinB)之間進行比較發現, 各物種之間成熟肽的同源性普遍都在70%以上, 表明其在進化過程中高度保守。在系統發育樹中, 卵形鯧鲹與其他魚類聚類, 而哺乳類、兩棲類、鳥類、爬行類則分別各自聚類, 并具有很高的Bootstrap值, 表明TroCatB與其他魚類的CatB親緣關系近, 暗示CatB基因在脊椎動物進化過程中相對保守, 這與它們的系統進化地位相適應。

3.2 CatB基因在不同組織中的表達分析

前人研究表明,CatB在機體抵御外源微生物入侵的過程中扮演著重要的角色。檢測TroCatB基因的mRNA在健康卵形鯧鲹各組織的表達分布發現,TroCatB主要表達于卵形鯧鲹的脾臟、鰓和腸中,這與牙鲆[15]和大菱鲆[18]的CatB基因在正常組織中的表達分布研究結果相類似, 與大黃魚[3]主要表達于脾臟、肝臟和腸相差異;TroCatB在脾臟組織中表達量最高, 這與條石鯛[14]主要在肝臟中表達相差異, 與斑點叉尾鮰[17]在后腎組織中主要表達相差異。以上結果表明,CatB在健康魚類的免疫器官或免疫組織中具有高水平表達, 暗示著CatB基因在魚類先天性免疫防御中發揮重要作用;TroCatB在脾臟組織中表達量最高, 暗示著CatB基因參與卵形鯧鲹的先天性免疫防御; 而不同魚類的CatB基因在組織中的表達分布差異, 可能與個體的種類、生活環境的差異、遺傳差異及生理狀態有關。

3.3 溶藻弧菌刺激對卵形鯧鲹脾臟和頭腎TroCatB mRNA水平的影響

經溶藻弧菌感染處理0—48h后,TroCatB基因在脾臟、頭腎組織中均有明顯表達變化, mRNA表達水平較對照組均顯著上調, 脾臟組織中的表達量在刺激6h后顯著上調約100.94倍, 頭腎組織中的表達量在刺激12h后顯著上調約86倍。此結果與斑點叉尾鮰經鮰愛德華菌(Edwardsiella ictaluri)免疫刺激[17]、牙鲆經脂多糖(LPS)刺激[15]、大菱鲆經遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)刺激后[18], 其CatB基因的表達量均顯著上調的結果類似。這些結果都揭示了魚類CatB基因參與了機體抗細菌免疫反應的相關活動。

本結果為進一步研究CatB基因的在卵形鯧鲹免疫系統中的重要地位及其功能奠定基礎和提供參考, 也對卵形鯧鲹養殖業的發展具有促進意義。