ELISA檢測KRT10_C和COL6A3_C短肽抗體的方法建立及作為RA診斷的應用價值

周 瑩，管曉龍，李曉軍，虞 偉，管世鶴，

(1.安徽醫科大學第二附屬醫院檢驗科，合肥 230601；2.安徽醫科大學附屬婦幼保健院檢驗科，合肥 230001；3.東部戰區總醫院中心實驗科，南京 210002)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis， RA)是一種具有高度異質性的自身免疫性疾病，其特征在于組織損傷、慢性炎癥和骨質破壞，甚至累及關節外器官(包括心臟，肺等)，導致預期壽命縮短[1]。抗瓜氨酸化蛋白抗體(anti-citrullinated proteins antibodies，ACPA)是所有能識別瓜氨酸修飾蛋白的抗體統稱[2]。抗環瓜氨酸化肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體在2010年被納入RA分類標準，廣泛應用于臨床實驗室診斷和病情監測[3-4]，但抗CCP抗體對RA的診斷仍有約20%的漏診率，且尚未有研究鑒定出具體哪些瓜氨酸化自身抗原在RA發生與發展中起重要作用。目前，已有四種瓜氨酸化自身抗原得到驗證，包括纖維蛋白原、波形蛋白、II型膠原蛋白和α-烯醇化酶[5]。本課題組的前期實驗通過質譜技術、肽芯片技術和生物信息學分析技術，對RA關節滑膜組織及RA血清免疫復合物中的瓜氨酸化蛋白進行鑒定和分析，以期完善RA特異性瓜氨酸化抗原譜。結果發現，角蛋白I型細胞骨架10(keratin type I cytoskeletal 10，KRT10)和VI型膠原蛋白A3[collagen alpha-3(VI) chain，COL6A3]與RA具有較高相關性。因此，本研究篩選了KRT10和COL6A3的原始肽和瓜氨酸修飾肽作為靶抗原，共合成了四種短肽，以臨床常規檢測的抗CCP抗體陽性和陰性血清進行抗體結合活性驗證，初步建立起KRT10_C和COL6A3_C短肽抗體檢測的ELISA方法，并探討該兩種短肽抗體在作為RA潛在診斷靶標中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年4～12月在東部戰區總醫院就診并進行抗CCP抗體檢測的患者血清共229例，當血清抗CCP抗體>5U/ml時，則認為該血清中含有抗瓜氨酸化蛋白抗體(ACPA)。ACPA陽性組100例，男性31例，女性69例，平均年齡58±16.2歲；健康對照組100例，男性43例，女性57例，平均年齡39±28.7歲；另有臨床明確診斷為RA的患者29例，其中抗CCP抗體陽性者19例，抗CCP抗體陰性者10例，平均年齡51±13.7歲。血清無脂血、溶血等不合格情況，收集于干燥潔凈EP管，-80℃凍存備用。

1.2 主要試劑與儀器 短肽粉末(上海強耀生物有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)、雙蒸水、PBS緩沖液(博士德生物有限公司)，吐溫20(北京Solarbio科技有限公司)，顯色液與終止液(上海科華生物工程股份有限公司)，ELISA酶標板(深圳金燦華實業有限公司)，酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 短肽合成：由上海強耀生物有限公司提供，共合成4條短肽，短肽序列如下：原始短肽KRT10： RLAADDF-R-LKYENEV，修飾短肽KRT10-C： RLAADDF-(Cit)-LKYENEV，原始短肽COL6A3： QDVVNAV-R-QLTLLGG，修飾短肽COL6A3-C：QDVVNAV-(Cit)-QLTLLGG。

1.3.2 實驗步驟：每管短肽粉末(1mg)加入500 μl DMSO及500 μl CBS溶解至清澈無渾濁，得到1mg/ml的短肽溶液，4℃冰箱備用。①包被：將1mg/ml短肽溶液和PBST按1∶200比例稀釋為5μg/ml，每孔100μl，37℃水浴箱孵育1h，4℃冰箱過夜，用PBST洗滌，拍干，重復4次；②封閉：牛血清清蛋白(PBST溶解為1 ml/dl)每孔150 μl，37℃水浴箱孵育1h，4℃冰箱過夜，用PBST洗滌，拍干，重復4次；③加血清樣本：1ml/dl牛血清清蛋白與樣本血清按1∶50比例稀釋，每孔100 μl，37℃水浴箱孵育1h，用PBST洗滌，拍干，重復4次；④加二抗：分別采用HRP標記兔抗人IgA，IgG與IgM按1∶3 000稀釋，每孔100 μl，37℃水浴箱孵育1h，用PBST洗滌，拍干，重復5次；⑤顯色與終止：加入底物A液2滴和B液2滴，避光顯色4 min，加終止液2滴終止反應；⑥讀板：A630nm/A450nm雙波長讀取吸光度A值。

1.4 統計學分析 實驗數據采用SPSS19.0進行統計學分析，兩組樣本之間采用配對樣本t檢驗。兩種短肽抗體對于RA診斷的應用價值采用ROC曲線進行評估。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血清ACPA與四種短肽抗原的結合反應 對100例ACPA陽性組及100例健康對照組進行ELISA檢測，結果見表1，表2。以抗人IgA，IgG為二抗時，陽性組的四種短肽抗原檢測值均高于相應對照組，差異具有統計學意義(均P<0.05)。以抗人IgM為二抗時，陽性組COL6A3和COL6A3_C檢測值與相應對照組差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 RA確診血清與四種短肽的ELISA檢測結果 對確診RA患者血清[RA抗CCP抗體(+)組19例，RA抗CCP抗體(-)組10例]進行ELISA檢測。以抗人IgG為二抗時，RA抗CCP抗體(+)組KRT10_C檢測值(0.82±0.058)明顯高于其他組檢測值，差異有統計學意義(P<0.05)；以抗人IgM為二抗時，RA抗CCP抗體(-)組COL6A3_C檢測值(0.41±0.043)明顯高于其他組檢測值，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 KRT10和KRT10_C吸光度A值

表2 COL6A3和COL6A3_C吸光度A值

2.3 兩種瓜氨酸化短肽抗體用于RA診斷的效果評價 KRT10_C在RA抗CCP抗體(+)組檢測值較高，COL6A3_C在RA抗CCP抗體(-)組檢測值較高。因此，篩選KRT10_C(以抗人IgG為二抗)和COL6A3_C(以抗人IgM為二抗)用于RA診斷并進行價值評價。依據100例健康對照組血清檢測KRT10_C短肽抗體(以抗人IgG為二抗)與COL6A3_C短肽抗體(以抗人IgM為二抗)的吸光度A值，取+2s確定KRT10_C短肽抗體(以抗人IgG為二抗)的cut-off值為0.5，COL6A3_C短肽抗體(以抗人IgM為二抗)的cut-off值為0.2。

KRT10_C短肽抗體的ELISA檢測(以抗人IgG為二抗)用于RA患者診斷的靈敏度為58.62%，特異度為52.17%，陽性預測值60.71%，陰性預測值52.17%，ROC曲線下面積為0.686，見圖1A。該類抗體僅用于診斷抗CCP抗體(+)RA患者時診斷的ROC曲線下面積可達0.895，見圖1B。

圖1 KRT10_C短肽抗體用于診斷RA的ROC曲線

與臨床診斷相比，COL6A3_C短肽抗體的ELISA檢測值用于RA患者診斷的靈敏度為65.52%，特異度為78.95%，陽性預測值82.61%，陰性預測值60%，ROC曲線下面積為0.724，見圖2C。有趣的是，該短肽抗體僅用于診斷抗CCP抗體(-)的RA患者準確性有很大提高，ROC曲線下面積可達0.956，見圖2D。

圖2 COL6A3_C短肽抗體用于診斷RA的ROC曲線

2.4 精密度評價 取ACPA低濃度(<0.05 U/ml)、中濃度(97.2U/ml)和高濃度(>200U/ml)患者血清各一份，以上述ELISA方法重復檢測20次，包被KRT10_C的ELISA檢測值(以抗人IgG為二抗)的批內變異系數分別為11.2%，7.8%和6.7%。COL6A3_C對RA(-)組檢測意義較大，RA(-)組無ACPA參照，因此取RA(-)組COL6A3_C低濃度(A值<0.2)、中濃度(A值=0.456)和高濃度(A值>0.6)患者血清各一份，以上述ELISA方法重復檢測20次，包被COL6A3_C的ELISA檢測(以抗人IgM為二抗)的批內變異系數分別為12.9%，8.4%和8.9%。

3 討論

本研究篩選了兩種短肽及其瓜氨酸修飾肽段作為ELISA檢測的靶抗原，實驗結果提示四種短肽與ACPA陽性組的結合活性高于健康對照組(以抗人IgA，IgG為二抗)，說明四種短肽與RA具有較高相關性。通過比較ELISA檢測結果和臨床實驗報告發現，KRT10_C短肽抗體的檢測值(以抗人IgG為二抗)較高的血清樣本的抗CCP抗體濃度水平也較高(多數濃度值>200U/ml)，提示該短肽抗體可能與抗CCP抗體濃度值存在正相關性。

角蛋白屬于中間絲蛋白的超家族，主要分為兩組：28種I型酸性蛋白質和26種II型堿性蛋白質。 I型和II型角蛋白形成異二聚體，用于組裝10nm細絲，為維持細胞完整性提供結構支持[6]。角蛋白作為一種多方面的細胞骨架蛋白，主要在上皮細胞的基底細胞中表達，可調節多種的生物過程，包括維持細胞完整性、調節細胞生長和遷移、以及減緩細胞凋亡。促炎細胞因子包括IL-17，IL-22，IFN-3，TGF-β，Nrf2和p53可通過轉錄和翻譯調控角蛋白表達。此外，磷酸化和泛素化等蛋白翻譯后修飾參與調節角蛋白功能和穩定性[7-8]。在角蛋白與RA相關性的前期研究中，NIENHUIS等[9-10]發現抗核周因子對頰黏膜細胞核周圍的角質透明顆粒具有反應性，抗核周因子在RA中具有特異性表達，但由于復雜的免疫熒光技術、選擇標本的繁瑣和實驗室間難以標準化，因而沒有被廣泛使用。此后，其他研究者發現抗核周因子與頰黏膜細胞中的絲聚蛋白特異性單克隆抗體共定位，并通過抗核周因子作為抗原和相關抗角蛋白抗體的生化特性得到證實和擴展，因此抗角蛋白抗體應該更準確地稱為“抗絲聚蛋白抗體”，被用于RA實驗室診斷與研究中[11]。在本次以抗人IgG為二抗的ELISA實驗中，KRT10_C較KRT10與ACPA結合活性升高。與其他組相比，抗KRT10_C短肽抗體在RA抗CCP抗體(+)組檢測值較高，差異具有統計學意義。同時，KRT10_C短肽抗體僅用于診斷RA抗CCP抗體(+)的ROC曲線下面積為0.895，可見KRT10_C短肽抗體對RA抗CCP抗體(+)患者的診斷價值較高。

VI型膠原蛋白珠狀微纖維存在于幾乎所有組織的細胞外基質中，與皮膚、腎臟、神經、血管和肌肉中的基底膜密切相關[12]，被認為是基底膜與周圍的細胞外基質錨定的主要作用物。在肌腱和角膜中，VI型膠原蛋白微纖維分布在肌腱纖維周圍；在軟骨中，細胞周圍基質富含VI型膠原蛋白微纖維，可保護軟骨細胞，減輕關節壓力。VI型膠原蛋白通過與各種細胞外基質蛋白的相互作用來促進這些橋接和錨定作用，包括其他膠原蛋白、蛋白多糖、纖連蛋白和微纖維相關糖蛋白1(MAGP1)[13]。同時，LAMANDE等[14]也發現VI型膠原蛋白缺乏會改變細胞外基質結構和生物力學特性，導致細胞凋亡和氧化應激增加，肌肉再生受損，RA中VI型膠原蛋白被瓜氨酸化修飾，極有可能因此影響了蛋白結構和功能，產生了與VI型膠原蛋白缺乏類似的生物學效應。

以抗人IgG為二抗的實驗中， COL6A3瓜氨酸修飾之后，與ACPA結合活性降低，提示并非所有瓜氨酸修飾后肽段與ACPA的結合活性都是升高的，有些蛋白的瓜氨酸修飾形式與ACPA的結合活性反而降低。但是，在確診RA但抗CCP抗體陰性的血清實驗(以抗人IgM為二抗)中，COL6A3_C短肽抗體的檢測值較其他組高。由此我們不禁猜想：當COL6A3為靶抗原時，極有可能產生IgM類抗體，而大多臨床實驗室檢測ACPA的二抗為抗IgG抗體，因而檢測不出IgM類COL6A3的抗體值，這可能是臨床實驗室診斷中RA患者出現抗體漏檢的重要原因。初步研究表明，COL6A3_C短肽抗體的ELISA檢測用于診斷抗CCP抗體陰性RA患者的ROC曲線下面積可達0.956，具有較高診斷價值，將有可能作為抗CCP抗體的有效補充。

綜上，KRT10_C和COL6A3_C短肽抗體的ELISA檢測，可完善RA實驗室診斷體系，提高RA早期診斷率，對降低RA疾病晚期致殘致畸率具有重要意義。同時，后續研究仍需進一步擴大樣本量，優化實驗條件，以期獲得更可靠的應用數據。