子癇前期患者胎盤組織整合素β1 熱休克蛋白70表達水平及臨床意義

忽 平 陳麗珍

子癇前期(preeclampsia,PE)是妊娠20周后出現新發高血壓、蛋白尿或其他系統損害的母體綜合征，可伴或不伴胎兒生長受限、羊水過少等胎兒綜合征，病因不明，是圍產兒死亡的主要原因之一[1]。整合素β1(integrinβ1,ITGβ-1)是由α和β 2種亞基通過非共價鍵構成的跨膜受體糖蛋白，是miR-29的靶基因之一，可介導細胞侵襲、滋養層細胞血管生成，參與PE發生[2]，但探究ITGB1與PE相關性的報道較少。而既往針對熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)的臨床報道多見于心血管疾病[3]，但有研究[4]指出，PE患者胎盤血氧缺乏，可促進多種細胞因子釋放，引起蛋白質變異性損傷，激活熱休克反應，此時HSP70作為分子伴侶保護蛋白多肽結構及功能。加之PE的部分誘發因素(如肥胖、血脂異常、胰島素抵抗等)、病理特征(炎癥、氧化應激、內皮細胞損傷等)與心血管疾病相似。因此，基于理論角度，HSP70可能與PE相關。基于此，本研究旨在探究PE患者胎盤組織ITGβ-1蛋白及mRNA、HSP70蛋白及mRNA的表達水平及臨床意義，以期為PE的臨床診治提供參考依據。具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2018年12月在南陽市中心醫院接受剖宮產分娩的120例PE孕婦為研究對象。參照《妊娠期高血壓疾病診治指南(2015)》[5]分為輕度子癇前期(mild preeclampsia, mPE)孕婦組(mPE組)、重度子癇前期(severe preeclampsia, sPE)孕婦組(sPE組)，每組各60例；另按1∶1∶1比例選取同期在本院分娩的正常孕婦60例設為對照組。sPE組孕周較mPE組短，收縮壓、舒張壓、尿蛋白水平高于mPE組(P<0.05)；但3組研究對象年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。本研究通過醫院倫理委員會審核通過。

表1 3組研究對象一般臨床資料比較

注：與對照組比較，*P<0.05；sPE組與mPE組比較，#P<0.05

1.2 納入與排除標準 納入標準：①mPE組和sPE組患者符合《妊娠期高血壓疾病診治指南(2015)》[5]中PE診斷要求；②均為單胎妊娠；③對照組孕婦剖宮產原因為瘢痕子宮、骨盆狹窄、臀位或社會因素；④對照組選取標準為在本院進行規范孕檢且檢查結果正常，并在本院分娩的孕婦；知曉研究內容并自愿簽署知情同意書。排除標準：①慢性高血壓；②合并糖尿病等代謝性疾病；③心、肝、腎等重要器官病變；④多胎妊娠。

1.3 方法 ①儀器與試劑：ITGβ-1及HSP70免疫組化試劑盒[ Max VisionTM(即用型快速免疫組化一步法試劑盒)]均購自上海西唐生物科技有限公司；ITGβ-1及HSP70一抗、二抗及二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DBA)顯色試劑盒購自鄭州金賽爾生物科技有限公司；顯微鏡購自日本Olympus公司；Trizol試劑盒購自美國Invotrogen公司；ITGβ-1、HSP70引物合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。熒光定量PCR儀型號為FTC2000(Cananda公司)、試劑盒購自美國Sigma公司。②胎盤組織收集：剖宮產術中胎盤娩出5 min內，于胎盤母體面中央近臍帶根部處剪取大小為2 cm×2 cm×1 cm的2塊全層胎盤組織，生理鹽水漂洗，無菌濾紙吸干，10%中性多聚甲醛溶液固定，室溫條件下酒精梯度脫水，過夜后石蠟包埋，并制成3 μm厚蠟塊備用。③ITGβ-1、HSP70蛋白表達：采用免疫組化法檢測，將胎盤組織蠟塊取出置于64℃烤箱過夜，然后浸泡二甲苯浸泡10%分后更換50%二甲苯浸泡5 min脫蠟，梯度酒精水化后蒸餾水沖洗；再將切片浸泡于二胺四乙酸(diamine tetraacetic acid，EDTA)抗原修復液，95～100℃加熱10～20 min，而后在20～30 min內冷卻至室溫，除去磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)并滴加50 μL 3%過氧化氫溶液室溫孵育，阻斷內源性過氧化物酶活性，封閉內源性抗體；滴加50 μL非免疫山羊血清，室溫下孵育10 min后滴加兔克隆抗體，室溫孵育60 min，加蓋濕盒蓋再孵育60 min，除去PBS后滴加50 μL Max VisionTM(即用型快速免疫組化一步法試劑盒)試劑，室溫孵育15 min；再二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DBA)顯色，蘇木精染色，ddH2O 洗滌終止染色，梯度酒精脫水，中性樹膠封固。400倍光學顯微鏡下觀察(以HSP70免疫組化分析為例)。由2位病理科醫師采用雙盲法閱片，每張切片隨機取5個視野，光學顯微鏡下觀察視野內細胞。染色強度分0、1、2、3分，分別對應細胞內無著染色、著色不清、呈均勻一致淡黃色與背景一致；細胞核或細胞漿內可見少量淡黃色顆粒，顯色高于背景；細胞核或細胞漿內可見較多深棕色顆粒；細胞核或細胞漿內可見大量棕黃色或棕褐色顆粒。陽性細胞百分率分0、1、2、3分，分別對應無陽性細胞、陽性細胞百分率<25%、陽性細胞率為25%～50%、陽性細胞率>50%。若細胞染色強度、陽性細胞百分率兩項乘積為0～3分則為陰性、4～9分為陽性。每張切片5個視野，取均值為最終得分。ITGβ-1蛋白、HSP70蛋白免疫組化步驟一致。觀察并記錄3組研究對象ITGβ-1蛋白、HSP70蛋白陽性表達率。④ITGβ-1 mRNA、HSP70mRNA：Trizol法提取胎盤組織總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄反應合成cDNA，再應用實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)法檢測ITGβ-1表達，PCR反應條件：95℃預變性1 min、95℃變性15 s、60℃退火、延伸1 min，40個循環，記錄熔解曲線，擴增產物4℃保存。2-△CT方法計算ITGβ-1 mRNA表達水平。HSP70 mRNA表達檢測方法參照ITGβ-1 mRNA，均嚴格按照試劑盒說明術操作。引物序列見表2。

表2 引物序列

2 結果

2.1 3組研究對象胎盤組織ITGβ-1的免疫組化比較 ITGβ-1蛋白定位于細胞膜及細胞質，mPE、sPE胎盤組織均可見棕黃色顆粒，且染色強度高于背景非特異性著色，對照組則不顯著。見圖1。

圖1 3組研究對象胎盤組織ITGβ-1表達(HE染色，×400)

注：A為對照組，B為mPE組，C為sPE

2.2 3組研究對象胎盤組織中HSP70免疫組化結果比較 HSP70蛋白定位于合體滋養細胞胞漿，正胎盤組織主要表達于細胞胞漿，陽性顆粒成其淺黃色；mPE患者胎盤組織中HSP70蛋白分布與輕度相同，陽性顆粒明顯增多，染色程度更深；而sPE患者的胎盤組織HSP70不僅表達于細胞胞漿，部分還覆蓋于細胞核，染色程度呈深棕色。見圖2。

圖2 3組研究對象胎盤組織中HSP70表達(HE染色，×400)

注：A為對照組，B為mPE組，C為sPE

2.3 3組研究對象胎盤組織中ITGβ-1、HSP70陽性表達率比較 3組研究對象胎盤組織中ITGβ-1、HSP70陽性表達差異有統計學意義(P<0.05)，mPE組、sPE組ITGβ-1陽性、HSP70陽性表達率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，但mPE、sPE組ITGβ-1、HSP70陽性表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組研究對象胎盤組織中ITGβ-1、HSP70陽性表達率比較[例(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05

2.4 3組研究對象胎盤組織中ITGβ-1 mRNA、HSP70 mRNA表達水平比較 3組研究對象胎盤組織中ITGβ-1 mRNA、HSP70 mRNA表達水平差異有統計學意義(P<0.05)；mPE組、sPE組ITGβ-1 mRNA、HSP70 mRNA高于對照組，且sPE組ITGβ-1 mRNA、HSP70 mRNA高于mPE組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組研究對象胎盤組織中ITGβ-1 mRNA、HSP70 mRNA表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與sPE組比較，#P<0.05

2.5 ITGβ-1 mRNA、HSP70 mRNA與臨床癥狀的相關性分析 Pearson相關性分析顯示，ITGβ-1 mRNA、HSP70 mRNA與PE患者收縮壓、舒張壓、尿蛋白水平均呈正相關關系(P<0.05)，且ITGβ-1 mRNA與HSP70 mRNA正相關(r=0.757，P<0.05)。見表5、圖3。

表5 ITGβ-1 mRNA、HSP70 mRNA表達與臨床癥狀的相關性分析(n=120)

圖3 ITGβ-1 mRNA、HSP70 mRNA與臨床癥狀的相關性分析

注：A為ITGβ-1 mRNA與臨床癥狀相關性分析散點圖；B為HSP70 mRNA與臨床癥狀相關性分析散點圖；C為ITGβ-1 mRNA與HSP70 mRNA相關性分析散點圖

3 討論

PE作為妊娠期特有疾病，其病因至今尚未能明確，且亦無明確的預防措施。ITGβ-1作為異二聚體跨膜蛋白，既往研究[6]證實其生物學作用與腫瘤疾病分化、浸潤、淋巴結轉移密切相關，作為腫瘤疾病診斷及預后評估治療亦取得滿意進展。隨著臨床研究的愈漸深入，有針對PE發病機制的研究指出，miR-29b可通過對ITGβ-1的調控誘導子癇發生[7]。莫玉俏等[8]報道，miR-29可通過對TGB1表達的調控作用參與PE發生。而李小葉等[9]雖報道PE患者胎盤組織中ITGβ-1表達顯著高于正常孕婦，認為ITGβ-1可介導細胞凋亡、侵襲及滋養層細胞血管生成，與PE發生、臨床癥狀密切相關，但該研究處于初級階段，未分析ITGβ-1在不同嚴重程度的PE患者胎盤組織中的表達情況。

而HSP70則是具多種功能的非特異性保護蛋白，且在進化上有高度保守性，在正常情況下呈基礎表達，水平較低；而對PE患者，受在發病期間受線粒體氧化應激、硝化應激、抗氧化劑水平降低等作用影響，線粒體HSP70可呈反應性上升現象，且較HSP27、HSP60，HSP70與外界刺激變化的相關性最為顯著[10]。基于當前研究PE患者胎盤組織ITGβ-1、HSP70表達水平及臨床意義類報道相對鮮見，加之基因翻譯表達蛋白質過程復雜，基因翻譯表達蛋白質過程復雜，因此，本研究在分析PE患者ITGβ-1、HSP70蛋白表達基礎上也對其mRNA進行分析。

本研究結果顯示mPE組、sPE組ITGβ-1蛋白、HSP70蛋白陽性表達及ITGβ-1 mRNA、HSP70mRNA表達水平顯著高于對照組，sPE組ITGβ-1 mRNA、HSP70mRNA表達顯著高于mPE組，且ITGβ-1 mRNA、HSP70mRNA表達與PE患者收縮壓、舒張壓、尿蛋白水平均呈正相關關系。提示PE患者胎盤組織ITGβ-1蛋白、HSP70蛋白及mRNA存在高表達相關，并與臨床癥狀密切相關。這與李小葉等、朱錦明等[11]的報道結論相似。分析PE患者胎盤組織ITGβ-1蛋白、ITGβ-1mRNA高表達的原因，筆者認為除卻miR-29b可通過對ITGβ-1的調控誘導子癇發生外，既往有報道指出，miR-155也可調控PE滋養層炎癥細胞IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達，加劇PE炎癥反應[12]，這也意味著ITGβ-1不僅可受miR-29調控，亦受miR-155調控[13-14]。同時，朱錦明等[15]則不僅報道PE患者胎盤組織中HSP70表達水平明顯升高，且在血清、臍血中呈相同趨勢。究其原因，分析或因PE患者在炎癥、缺氧等應激狀態影響下，HSP70表達應激性上調，發揮內源性保護機制以對抗炎癥反應及缺氧損傷有關，這在林培紅等[16]的報道中也得到證實。同時，本研究還顯示，PE患者胎盤組織HSP70 mRNA與ITGβ-1 mRNA表達同樣存在顯著正相關關系，分析或因HSP70 與ITGβ-1均在一定程度上受miR-29、miR-155調控有關[17-18]，但其具體機制仍有待后期研究進一步明確，尤其是ITGβ-1與HSP70在PE發病過程中是否有協同作用。

綜上所述，ITGβ-1、HSP70在PE患者胎盤組織中高表達，并與臨床癥狀密切相關，值得臨床重視。但本研究也存在一定局限性，除卻樣本量相對少外，亦存在一定混雜因素影響。ITGβ-1、HSP70與PE的相關性及其在PE發病過程中的具體機制、是否存在協同作用等仍有極大深入探究空間。