棉鈴蟲鞣化激素基因克隆及分子特性分析

馬星宇，嵇玉潔，薛玉瑩，杜孟芳，魏紀珍，尹新明，劉曉光，安世恒

(河南農業大學植物保護學院/省部共建小麥玉米作物學國家重點實驗室，鄭州 450002)

0 引 言

【研究意義】棉鈴蟲Helicoverpaarmigera，是棉花、玉米、番茄和煙草作物上危害較為嚴重的一類雜食性害蟲。近年來，國內玉米等夏季作物種植結構的調整，棉鈴蟲抗藥性有加重趨勢，用藥不規范及過量用藥等問題突出，其對農業生產造成的損失逐年增加[1-2]。鞣化激素(bursicon)是由異源二聚體蛋白組成的一類神經肽類激素，在昆蟲表皮發育及鞣化過程中扮演重要角色。了解昆蟲體內重要激素的功能機制，對田間害蟲綠色防控提供新靶標有重要意義。【前人研究進展】昆蟲的體壁(外骨骼)不但能夠避免蟲體內水分的散失，而且能夠有效抵御外界病原微生物的入侵、降低蟲體遭受的環境機械物理傷害程度[3]。真皮細胞分泌形成的新表皮通常柔軟脆弱，蟲體得以延伸后，新表皮在短時間內被迅速鞣化，保護昆蟲免受外界傷害[4]。Fraenkel和Hsiao[5](1962)對剛羽化的紅頭麗蠅Calliphoraerythrocephala頸部結扎，結果發現其胸部和腹部表皮不能正常黑化，Fraenkel 和Hsiao(1965)隨后將導致這一現象的鞣化因子命名為鞣化激素(Bursicon，burs)[6]。除昆蟲外，有關鞣化激素在甲殼類動物[7]、蛛形綱[8]和棘皮動物中也有報道[9]。昆蟲在幼(若)蟲各齡期及變態期均需蛻去舊表皮，形成新表皮，最終形成完整的外骨骼。此過程包含兩個階段，即前蛻皮期(pre-ecdysis)和蛻皮期(ecdysis)。其間有眾多荷爾蒙(激素)參與蛻皮和新表皮的鞣化形成。蛻皮前期，蟲體血淋巴中蛻皮激素(ecdysone，Ecd)滴度急速下降，蛻皮觸發激素(ecdysis-triggering hormone，ETH)隨之也釋放出來[10]。Ecd與ETH的滴度變化進一步促進了羽化激素(eclosion hormone，EH)EH合成與釋放，同時EH又促進ETH的分泌，這些激素共同作用，形成一個正調控循環，協同促進昆蟲進行蛻皮[11]。EH又促進了甲殼類動心肽(crustacean car-dioactive peptide，CCAP)轉錄與活性多肽的釋放，隨著CCAP滴度的升高，預示著激素參與前蛻皮階段進入尾聲，蛻皮前期信號途徑關閉。接下來昆蟲進入蛻皮期，CCAP促進了鞣化激素達進，分泌的鞣化激素入血淋巴，與靶標受體結合后，迅速引起cAMP水平上升，進而并增強昆蟲心臟的脈動，開啟鞣化激素調控昆蟲表皮鞣化的蛻皮后階段[12-15]。在參與昆蟲蛻皮過程眾多激素中，鞣化激素較為特殊，它是一類天然異源二聚體肽類激素，由α亞基(Bursicon，burs)和β亞基(partner of burs，pburs)組成，可形成胱氨酸結構[16-17]。研究發現，其在腦、心側體、咽側體、胸神經節以及腹部神經節等中樞神經系統部位的勻漿中均檢測到具有活性多肽[18]。利用鞣化激素特異性抗體和DNA探針，Dewey等[19](2004)發現，其在煙草天蛾Manducasexta、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster等昆蟲咽下神經節、胸神經節以及腹神經節均能夠合成burs和pburs。除中樞神經系統外，鞣化激素在黑腹果蠅D.melanogaster中腸內分泌細胞也有表達，且在功能上與中樞神經互相獨立。在激素水平上，幾乎所有昆蟲鞣化激素均由中樞神經系統合成并釋放到血淋巴中，經由血淋巴循環到達目標組織或細胞，發揮功能[20]。【本研究切入點】影響棉鈴蟲幼蟲生長發育的一些重要基因仍有待挖掘，如鞣化激素在棉鈴蟲中尚未報道。目前，國內外對鞣化激素的研究主要集中于煙草天蛾M.sexta[21]、黑腹果蠅D.melanogaster[22]、赤擬谷盜Triboliumcastaneum[23]、小菜蛾Plutellaxylostella[24]、禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi[25]、桃蚜Myzuspersicae[26]、南亞實蠅Zeugodacustau[27]等模式昆蟲，對棉鈴蟲幼蟲生長發育調控功能的研究相對薄弱。研究利用分子生物學與生物信息學技術，獲取棉鈴蟲鞣化激素相關序列。【擬解決的關鍵問題】以棉鈴蟲為材料，研究該基因的分子特性。利用分子生物學與生物信息學技術分析棉鈴蟲鞣化激素的2個亞基全長序列。利用qRT-PCR技術，研究鞣化激素α與β亞基在棉鈴蟲不同發育階段和不同組織中的轉錄水平，為研究鞣化激素相關基因的分子特性和功能，以及激素引起的昆蟲代謝通路和分子調控機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試昆蟲

棉鈴蟲為室內人工飼料飼養，飼養溫度(26±1)℃，相對濕度65%，光周期16L∶8D。

1.1.2 主要試劑

總RNA提取試劑(Trizol Reagent)購自Invertrigen公司；體外轉錄試劑盒購自ABI公司；2×TaqDNA聚合酶、限制性內切酶(EcoRⅠ、HandШ等)、pMD19-T載體、DNA Marker、熒光定量試劑盒(SYBR Primer Script RT-PCR Kit)、反轉錄試劑盒(Prime ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit)購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、產物純化試劑盒和質粒提取試劑盒、IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)以及X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)為生工生物工程(上海)股份有限公司產品，使用的其它試劑均為國產或進口分析純。

1.2 方 法

1.2.1 棉鈴蟲鞣化激素基因的獲得及同源序列

實驗室前期獲得的棉鈴蟲轉錄組unigene建立本地數據庫，利用家蠶鞣化激素氨基酸序列(GenBank登錄號，α亞基NP_001091845.1；β亞基NP_001037289.1)作為誘餌蛋白分別進行本地核苷酸tBlastn檢索比對，釣取棉鈴蟲候選基因核苷酸序列，將e值<1的序列逐個在線同源比對，將序列同源比對結論為鞣化激素的候選序列進一步分析，獲得棉鈴蟲鞣化激素α與β亞基候選cDNA序列，與棉鈴蟲基因組數據庫比對，驗證其正確性；搜集其他已知昆蟲鞣化激素氨基酸序列，根據搜集到的鞣化激素氨基酸序列，在MEGA 7(7. 0.14)軟件中，選擇Jones-Taylor-Thornton(JTT)模型，利用最大相似法(maximum likelihood method)構建系統進化樹進行聚類分析[27]。

1.2.2 棉鈴蟲不同發育期組織樣品解剖

在棉鈴蟲卵期至成蟲期收集不同發育期蟲體(卵)，包括雌性成蟲新產下的卵(2 h內)作為第1 d，其余依次后推(卵期1～3 d)，幼蟲期各齡(包含蛻皮期)、蛹(包含預蛹期)與成蟲(羽化后前2 d成蟲)，卵期取整卵(50粒為1組，其余5頭1組，共3次重復)。

1.2.3 棉鈴蟲5齡幼中樞神經組織樣品解剖

腦與神經組織樣品解剖選擇在5齡幼蟲第3 d，在“T”視鏡(萊卡)視野下下將幼蟲用昆蟲針固定，顯微解剖鑷解剖中樞神經系統，分別解剖腦、咽下神經節(1節)、胸神經節(3節)、腹神經節(7節)，立即置于Trizol試劑中(30頭為1組次，共3次重復)。

1.2.4 鞣化激素α與β亞基基因不同發育期與神經組織表達

獲得的棉鈴蟲α與β亞基基因序列設計特異性引物，以棉鈴蟲內參引物18S rRNA(GenBank: KT343378)為研究中內參引物[28]。設計棉鈴蟲其它引物及對照引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。將不同發育期和5齡幼蟲第3 d中樞神經組織樣品取出備用，對于不同發育期樣品的處理，先用液氮在研缽里充分研磨，取混勻后適量樣品分別放入含有400～900 μL不等Trizol Reagent的PE管中；對于中樞神經組織的處理，直接在無RNA酶的離心管中加液氮迅速冷凍，充分研磨。分別提取得到相應的總RNA，取1 μL用NanoDropTM檢測，依次記錄其濃度和RNA質量，保證OD260/OD280比值在2.0左右。獲得的各組織總RNA按照反轉錄試劑盒操作步驟合成cDNA: g DNA Eraser Buffer 2 μL, 1 μL g DNA Eraser, 0.8 μg不同組織的總RNA, 6.2 μL RNase free dH2O，配制成10 μL體系，42℃反應2 min，冰上加入5×PrimeScript?Buffer 2 μL, PrimeScript?RT Enzyme MixⅠ1 μL, RT Primer Mix 1 μL, RNase free dH2O4μL。混合均勻后在37℃反應15 min，85℃反應5 s，樣品-80℃保存以備qRT-PCR使用。不同基因表達水平檢測采用ABI7500 qRT-PCR儀(ABI, Carlsbad, CA, 美國)。以18S rRNA作為內參基因，反應體系10 μL: SYBRPremixExTaqTM(2×)5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA模板0.5 μL, DEPC處理過的滅活ddH2O 4.5 μL。擴增條件: 95℃預變性3 min; 95℃變性15 s, 60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共計40個循環，溶解曲線分析后除去非特異性樣品數據，每樣品次3個技術重復，重復3次。利用2-△△Ct方法分析基因轉錄的差異，△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因；△△Ct=△Ct處理-△Ct參考基因[28-29]。 表1

表1 設計引物Table 1 Primers designed for research

1.3 數據處理

數據結果參照Yue等(2016)和Du等(2017)統計學分析方法[30-31]，即取3次生物學實驗重復，誤差計算3次重復的標準差；數據處理首先采用DPS軟件(DPS7.05單機版)進行分析處理，不同時間點兩兩間的差異顯著采用獨立樣本t檢驗，不同數據間差異顯著采用單因素方程分析。

2 結果與分析

2.1 棉鈴蟲鞣化激素基因序列及系統進化

利用棉鈴蟲轉錄組unigene序列建立核苷酸本地BLAST數據庫，以家蠶鞣化激素不同亞基氨基酸序列為誘餌蛋白，從轉錄組數據庫中分別調取棉鈴蟲鞣化激素α與β亞基同源基因cDNA序列。通過與棉鈴蟲基因組核苷酸序列比對，分別確認并獲得棉鈴蟲鞣化激素α與β亞基基因cDNA全長序列。其中α亞基cDNA全長為694 bp，其中開放閱讀框全長480 bp，編碼159個氨基酸殘基，預測該蛋白質分子量分別為17.7 kDa；β亞基cDNA全長為779 bp，其中開放閱讀框全長420 bp，編碼139個氨基酸殘基，預測其蛋白質分子量為15.9 kDa。將棉鈴蟲鞣化激素α與β亞基基因核苷酸序列提交GenBank，分別獲得序列登錄號: AHM0247472.1和AHM0247473.1。圖1，圖2

注(Note)：黑色陰影表示100%一致，灰色為50%～90%，白色為50%以下
Amino acids 100% identical are in black box, 50%-90% identical in grey box and identi cal below 50% in white box
Bb家蠶Bombyxmori(NP_001091845.1); Ms煙草天蛾Manducasexta(XP_030027854.1)；Hv煙芽夜蛾Heliothisvirescens(PCG80721.1)；Ha棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(AHM02472.1) ；Bg德國小蠊Blattellagermanica(PSN41953.1)；Ls灰飛虱Laodelphaxstriatellus(AXF48185.1)；Dm黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(NP_650983.1)；Tc赤擬谷盜Triboliumcastaneum(ABA40402.1)；Am意大利蜜蜂Apismellifera(NM_001098234.1)
圖1 棉鈴蟲與其他昆蟲鞣化激素α亞基氨基酸同源比對
Fig. 1 Multiple sequence alignment of Bursicon-αfromH.armigerawith the homologs in other insects

注(Note)：黑色陰影表示100%一致，灰色為50%～90%，白色為50%以下
Amino acids 100% identical are in black box, 50%-90% identical in grey box and identical below 50% in white box
Bb 家蠶Bombyxmori(NP_001037289.1); Ms煙草天蛾Manducasexta(XP_030027856.1)；Hv煙芽夜蛾Heliothisvirescens(PCG80722.1)；Ha棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(AHM02473.1) ;Ls灰飛虱Laodelphaxstriatellus(AXF48186.1)；Dm黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(NP_609712.1)；Am意大利蜜蜂Apismellifera(NP_001035352.2);Tc赤擬谷盜Triboliumcastaneum(NP_001107780.1)；Bg德國小蠊Blattellagermanica(PSN41954.1)
圖2 棉鈴蟲與其他昆蟲鞣化激素β亞基氨基酸同源比對
Fig. 2 Multiple sequence alignment of Bursicon-βfromH.armigerawith the homologs in other insects

研究表明，棉鈴蟲鞣化激素α亞基與其它昆蟲中該基因所編碼氨基酸序列一致性在53%以上，其中與煙蚜夜蛾Heliothisvirescens氨基酸序列一致性最高，為94%，其次是家蠶Bombyxmori一致性為74%，與家蠶Bombyxmori一致性為69%，與德國小蠊Blattellagermanica、灰飛虱Laodelphaxstriatellus、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、赤擬谷盜Triboliumcastaneum和意大利蜜蜂Apismellifera等氨基酸序列一致性較低，分別為59%、56%、53%、56%和53%。棉鈴蟲鞣化激素α亞基與家蠶等鱗翅目昆蟲該基因很好地聚在一起，以果蠅D.melanogaster為代表的雙翅目、以赤擬谷盜為代表的鞘翅目、以白蟻和蟑螂為代表的蜚蠊目同時分別很好的聚在了一起，而意大利蜜蜂單獨聚為一支。圖3

注(Note)：Bb家蠶Bombyxmori(NP_001091845.1); Ms煙草天蛾Manducasexta(XP_030027854.1)；Cs二化螟Chilosuppressalis(ALM30306.1)； Hv煙芽夜蛾Heliothisvirescens(PCG80721.1)；Tn粉紋夜蛾Trichoplusiani(XP_026733509.1); Ha棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(AHM02472.1) ；Gm蠟螟Galleriamellonella(XP_026749033.1)；Px小菜蛾Plutellaxylostella(AJM76770.1)；Cp蘋果蠹蛾Cydiapomonella(QDK59883.1)；Zn濕木白蟻Zootermopsisnevadensis(XP_021930557.1)；Bg德國小蠊Blattellagermanica(PSN41953.1)；Ls灰飛虱Laodelphaxstriatellus(AXF48185.1)；Bd橘小實蠅Bactroceradorsalis(XP_029409224.1)；Zt南亞實蠅Zeugodacustau(QBE90576.1)；Nl褐飛虱Nilaparvatalugens(XP_022197712.1)；Dm黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(NP_650983.1)；Agl光肩星天牛Anoplophoraglabripennis(XP_018569360.1)；Tc赤擬谷盜Triboliumcastaneum(ABA40402.1)；Aga岡比亞按蚊Anophelesgambiae(Q66Q82.1)； Ld馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata(XP_023014168.1)；So米象Sitophilusoryzae(XP_030754853.1)；Aa埃及伊蚊Aedesaegypti(P85316.1)；Rm禾谷縊管蚜Rhopalosiphummaidis(XP_026815117.1)；Am意大利蜜蜂Apismellifera(NM_001098234.1); Mp桃蚜Myzuspersicae(XP_022171710.1)
圖3 最大相似法構建的基于昆蟲鞣化激素α亞基氨基酸序列系統進化樹 (MEGA ver. 7.0.14, 1 000次重復)
Fig. 3 Molecular phylogenic analysis of the burs-αfrom different insect species based on amino acid sequences by maximum likelihood method (MEGA ver. 7.0.14, 1，000 replicates)

而棉鈴蟲鞣化激素β亞基與其它昆蟲中該基因所編碼氨基酸序列一致性也在在43%以上。序列比對還發現，與煙蚜夜蛾H.virescens氨基酸序列一致性最高，達97%，家蠶B.mori和煙草天蛾M.sexta，一致性69%。與α亞基序列分析一致，鞣化激素β亞基在夜蛾科中首先聚在一起，然后再螟蛾科大拉螟G.mellonella和二化螟C.suppressalis聚在一起。其次與同屬蠶蛾科的家蠶B.mori、天蛾科的煙草天蛾M.sexta聚在一起，最后與卷蛾科的蘋果蠹蛾C.pomonella、菜蛾科小菜蛾P.xylostella等其它鱗翅目害蟲聚在一起，形成一個龐大的鱗翅目家族。以赤擬谷盜為代表的鞘翅目、以果蠅為代表的雙翅目、以白蟻和蟑螂為代表的蜚蠊目等昆蟲均很好的聚在了一起。以蜜蜂為代表的膜翅目單獨聚為一支。這與鞣化激素氨基的酸序列同源聯配分析結果相一致。圖4

在棉鈴蟲鞣化激素α與β亞基氨基酸序列中也發現具有典型的鞣化激素胱氨酸蛋白結構，其中半胱氨酸C1與C7，C2與C8，C3與C9，C4與C10，C5與C11可通過二硫鍵相連接。圖4

注(Note)：Bb 家蠶Bombyxmori(NP_001037289.1); Ms煙草天蛾M.sexta(XP_030027856.1)；Hv煙芽夜蛾H.virescens(PCG80722.1)；Ha棉鈴蟲H.armigera(AHM02473.1) ; Tn粉紋夜蛾T.ni(XP_026733510.1)；Gm蠟螟G.mellonella(XP_026749002.1)；Cs二化螟C.suppressalis(ALM30307.1); Px小菜蛾P.xylostella(AJM76771.1)；Cp蘋果蠹蛾C.pomonella(QDK59884.1)；So米象S.oryzae(XP_030754854.1)；Ld馬鈴薯甲蟲L.decemlineata(XP_023014169.1)；Ls灰飛虱L.striatellus(AXF48186.1)；Agl光肩星天牛A.glabripennis(XP_018569361.1)；Nl褐飛虱N.lugens(XP_022190952.1)；Aa埃及伊蚊Aedesa.(XP_001663910.1)；Dm黑腹果蠅D.melanogaster(NP_609712.1)；Mp桃蚜M.persicae(XP_022171709.1)；Zn濕木白蟻Z.nevadensis(XP_021930558.1)；Rm禾谷縊管蚜R.maidis(XP_026815130.1)；Zt南亞實蠅Z.tau(QBE90577.1)；Bd橘小實蠅B.dorsalis(XP_011213771.1)；Am意大利蜜蜂A.mellifera(NP_001035352.2); Aga岡比亞按蚊A.gambiae(CAH74225.1)；Tc赤擬谷盜T.castaneum(NP_001107780.1)；Bg德國小蠊B.germanica(PSN41954.1)
圖4 最大相似法構建的基于昆蟲鞣化激素β亞基氨基酸序列系統進化樹 (MEGA ver. 7.0.14, 1 000次重復)
Fig. 4 Molecular phylogenic analysis of the burs-βfrom different insect species based on amino acid sequences by maximum likelihood method (MEGA ver. 7.0.14, 1，000 replicates)

2.2 棉鈴蟲鞣化激素基因在不同發育期相對表達模式

研究表明，棉鈴蟲鞣化激素α基因在卵期第3 d、1齡幼蟲第2 d、2齡幼蟲第1 d、3～5幼蟲第1 d；2齡和3齡末蛻皮期(3M、4M)、蛹期第0 d、第3 d和第7 d表達量相對較高，自蛹期第7 d至成蟲羽化后相對表達量開始下降。圖5

而棉鈴蟲鞣化激素β基因在卵期至2齡末蛻皮期(3M)持續高水平表達。自3齡第1 d始迅速下降，但在3齡幼蟲第2 d、4與5齡幼蟲第1 d相對表達量較高；自蛹期第1 d開始至羽化前表達量相對較高，羽化后成蟲體內相對表達量開始下降。圖6

注(Note):E1～ 3: 分別為1～ 3日齡卵1～3-d～ay-old egg, respectively; 1-1～2: 分別為1齡幼蟲第1～ 2 dDay 1～ 2 1st instar larva, respectively; 2-1～ 2: 分別為2齡幼蟲第1～ 2 dDay 1～ 2 2nd instar larva, respectively; 3-1～ 2:分別為3齡幼蟲第1～ 2 dDay 1- 2 3rd instar larva, respectively; 4-1～ 2:分別為4齡幼蟲第1～2 dDay 1～2 4th instar larva, respectively; 5-1～5:分別為5齡幼蟲第1～5 dDay 1～5 5th instar larva, respectively; M: 蛻皮期Molting stage; PP: 預蛹期Pre-pupal stage; P0～10: 化蛹后0～10 d0～10 d after pupation; A1～2: 分別為1和2日齡成蟲1～2-day-old adult. 圖中數據為平均值±標準誤，不同小寫字母代表基因表達差異顯著(P<0.01; ANOVA和Tukey氏檢驗)。Data in the figure are mean±SE. Statistically significant differences are denoted by different capital letters (ANOVA and Tukey's test,P<0.01)
圖5 鞣化激素-α亞基基因在棉鈴蟲不同發育階段的表達水平
Fig. 5 Developmental expression profiles of bursion-αin H. armigera

注(Note): E1-3: 分別為1～3日齡卵1-3-day-old egg,respectively; 1-1～2: 分別為1齡幼蟲第1～2 dDay 1～2 1st instar larva, respectively; 2-1～2: 分別為2齡幼蟲第1～2 dDay 1～2 2nd instar larva, respectively; 3-1～2:分別為3齡幼蟲第1～2 dDay 1～2 3rd instar larva, respectively; 4-1～2:分別為4齡幼蟲第1～2 dDay 1～2 4th instar larva, respectively; 5-1～5:分別為5齡幼蟲第1～5 dDay 1～5 5th instar larva, respectively; M: 蛻皮期Molting stage; PP: 預蛹期Pre-pupal stage; P0～10: 化蛹后0～10 d，0-10 d after pupation; A1～2: 分別為1和2日齡成蟲1～2-day-old adult. 圖中數據為平均值±標準誤，不同小寫字母代表基因表達差異顯著(P<0.01; ANOVA和Tukey氏檢驗)。Data in the figure are mean±SE. Statistically significant differences are denoted by different capital letters (ANOVA and Tukey's test,P<0.01)
圖6 鞣化激素-β亞基基因在棉鈴蟲不同發育階段的表達水平
Fig. 6 Developmental expression profiles ofburs-βin H. armigera

2.3 棉鈴蟲鞣化激素α亞基、β亞基在棉鈴蟲中樞神經系統的相對表達量

研究表明，在棉鈴蟲胸神經節中的相對表達量較高，尤其是在胸神經節第2節中表達量最高，其次是第3節，第1節也有較高水平；咽下神經節相對表達量低于胸神經節前相對表達量，但顯著高于腦部與腹部表達量，腹神經節也有不同程度表達，但總體相對較弱。圖7

注；Br：腦；SOG：食管下神經節；TG：胸神經節；AG：腹神經節。圖中數據為平均值±標準誤，不同小寫字母代表基因表達差異顯著(P<0.05; ANOVA和Tukey氏檢驗)
Note:Data in the figure are mean±SE. Statistically significant differences are denoted by different capital letters (ANOVA and Tukey's test,P<0.05)
圖7 鞣化激素-α在棉鈴蟲中樞神經系統的相對表達水平
Fig. 7 Relative expression levels of bursion-αin nervous system ofH.armigera

注；Br：腦；SOG：食管下神經節；TG：胸神經節；AG：腹神經節。圖中數據為平均值±標準誤，不同小寫字母代表基因表達差異顯著(P<0.05; ANOVA和Tukey氏檢驗)
Note:Data in the figure are mean±SE. Statistically significant differences are denoted by different capital letters (ANOVA and Tukey's test,P<0.05)
圖8 鞣化激素β亞基基因在棉鈴蟲中樞神經系統的相對表達水平
Fig. 8 Relative expression levels of bursion-βin nervous system ofH.armigera

對于β亞基而言，表達模式與α亞基具有一致性，β亞基在胸神經節中相對較高，咽下神經節次之，腦部和腹部相對表達量較弱，其中腹部第1節與第3節、第4節和第7節差異不顯著，但與腦部表達量有顯著差異；除腹部第1節外，其余腹部相對表達量差異不顯著。圖8

3 討 論

昆蟲在不同蟲態及生長發育過程中，離不開舊表皮的蛻去和新表皮的的形成。在此過程中，鞣化是一個必不可缺的復雜的生理過程，鞣化包括黑化和硬化兩個相對獨立的過程，硬化的表皮既可以維持昆蟲的形態，也可以抵御外界病原物的入侵[3]。鞣化激素的發現及研究至今已經有50多年的時間，目前，對鞣化激素的研究多集中于果蠅、赤擬谷盜、煙草天蛾等模式昆蟲，而且有關同聚體的功能還未完全清楚。

以重要農業害蟲棉鈴蟲為研究材料，依據幼蟲神經組織轉錄組unigene建立了本地核苷酸數據庫，根據同源克隆的方法，利用生物信息學技術獲得了棉鈴蟲α亞基和β亞基的全長序列，其α亞基基因全長為694 bp,其中開放閱讀框全長480 bp，編碼160個氨基酸殘基，β亞基基因全長為779 bp,其中開放閱讀框全長420 bp，編碼140個氨基酸殘基。對氨基酸序列分析發現，α亞基和β亞基均含有保守的半胱氨酸殘基，其它氨基酸序列也相對比較保守，鞣化激素在鱗翅目昆蟲之間不僅保守，也可能具有一定的跨物種活性，對昆蟲的生長發育有不可替代的作用。

通過qPCR檢分析鞣化激素α亞基和β亞基在棉鈴蟲體內的時空表達模式，結果表明，二者在棉鈴蟲各個發育階段均有表達，但在卵期和蛹期表達量相對較高，這與之前在果蠅和家蠶中的鞣化激素在蛹期表達量較高的研究中得到的結論基本相符[19，32]。鞣化激素在蛹期較高水平表達，可能與棉鈴蟲羽化后成蟲體壁的鞣化和翅的延展有關；鞣化激素在棉鈴蟲卵期高水平表達，可能為卵殼的硬化和黑化做準備。此外，檢測棉鈴蟲神經系統的各個神經節發現，鞣化激素主要是由胸部神經節合成的，但是在腦和腹部神經節中表達量極低，有研究表明，美洲大蠊和煙草天蛾的胸神經節和腹部神經節均檢測到鞣化激素的較高表達[16，21]，這可能與物種間的的個體差異有關，棉鈴蟲鞣化激素α亞基和β亞基在幼蟲及成蟲期的生理與生化功能還需進一步驗證。

4 結 論

鞣化激素在昆蟲之間具有較高的保守性，與其它已知昆蟲發表序列類似，棉鈴蟲鞣化激素α與β亞基氨基酸序列中也發現具有典型的鞣化激素胱氨酸蛋白結構，其中半胱氨酸C1與C7，C2與C8，C3與C9，C4與C10，C5與C11可通過二硫鍵相連接。鞣化激素在棉鈴蟲各個發育階段均有表達，其中α亞基在卵期第3 d、1齡幼蟲第2 d、2齡幼蟲第1 d、3～5齡幼蟲第1 d； 2齡和3齡末蛻皮期(3M、4M)、蛹期第0 d、第3 d和第7 d表達量相對較高。而β亞基在卵期至2齡末蛻皮期(3M)持續高水平表達，在3齡幼蟲第2 d、4與5齡幼蟲第1 d和蛹期表達量相對較高。鞣化激素主要是由棉鈴蟲幼蟲胸部神經節合成的，在腦和腹部神經節中表達量極低。