棉鈴蟲鞣化激素β亞基參與脂肪組織免疫的相關功能基因表達模式

嵇玉潔，馬星宇，宋永輝，杜孟芳，魏紀珍，尹新明，劉曉光，安世恒

(河南農業大學植物保護學院/省部共建小麥玉米作物學國家重點實驗室, 鄭州 450002)

0 引 言

【研究意義】鞣化激素(Bursicon，burs)是一類天然異源二聚體多肽類激素，在昆蟲及甲殼綱動物中普遍存在[1]。昆蟲表皮發育及鞣化，需要在諸多激素及其受體參與的一系列信號通路協同下完成，其中鞣化激素作為該通路中的重要成員之一，還參與免疫等其它重要功能[1-2]。對棉鈴蟲鞣化激素β亞基(burs-β)及其表達的同聚體激素進行研究，為研究其參與幼蟲生長發育提供理論基礎，且對降低鱗翅目免疫及抗性、有效控制害蟲，尋找新靶標基因具有重要意義。【前人研究進展】研究發現，α亞基(burs- )與β亞基組成的鞣化激素異源二聚體可以與其受體G蛋白偶聯受體Rickets特異結合，迅速激活環腺苷/蛋白激酶A (cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A, cAMP/PKA)信號通路，PKA進一步激活下游關鍵基因，參與昆蟲生長發育[3-4]。2個亞基也可在體內形成α亞基或β亞基同源二聚體[2-3]。與其異源二聚體有所不同，鞣化激素同源二聚體以誘導體內某些抗菌肽基因的轉錄變化，參與免疫應答反應[4]。對頸部結扎的黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)注射重組burs-β，能引起一系列免疫反應相關基因的表達，并且所引起免疫反應的強度同注射重組蛋白的劑量和時間有關。將注射重組鞣化激素蛋白的蟲體勻漿液，與革蘭氏陰性菌Escherichiacoli共培養，發現能夠顯著抑制細菌的生長[4]。表皮鞣化是伴隨著蛻皮而發生的。由于天敵的襲擊或者簡單的接觸損傷都能對昆蟲柔軟表皮造成不同程度的傷害，抗菌肽強有力的防御作用是這個時期的昆蟲所必需的。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是昆蟲天然免疫系統的重要組成部分[5]。昆蟲抗菌肽主要在脂肪細胞內合成，在上皮細胞、生殖道、馬氏管和氣管等也有表達，其感染病原菌后隨即引起體內上皮細胞、脂肪體誘導表達抗菌肽，這些抗菌肽通過分泌到淋巴液中執行相關功能[6]。研究表明，burs介導角質層鞣化和翅的伸展[7-9]，引起鞣化途徑中的cAMP/PKA信號傳導途徑和酪氨酸羥化酶活化[10]。在黑腹果蠅(D.melanogaster)中，2條不同的信號傳導途徑，即Toll和IMD(Immune deficiency)途徑，負責病原體的識別和抗微生物免疫反應的激活[11]。burs通過激活轉錄因子的表達，通過IMD途徑介導免疫反應[4]。Buchon 等及Dutta 等[12-14]分別通過體外細胞實驗，分析果蠅中腸和人細胞特異性表達譜數，結果發現α亞基在成蟲中腸內分泌細胞中表達，α亞基也可以與受體Rickets結合，引起cAMP的活性增加，而β亞基沒有表達，可能β亞基在此過程中是非必須的。鞣化激素兩種同源二聚體某些時候是以Rickets為直接受體結合，某些組織中似乎不是通過連接Rickets起作用的，該2種同源二聚體可能是經由未發現的新的受體來調控抗菌肽表達的[4]。【本研究切入點】剛蛻皮的棉鈴蟲表皮是柔軟的(在表皮硬化和黑色素化之前)，并且更容易受到傷害和感染。此時可能由于微生物者或簡單的接觸傷害而在軟角質層中出現穿孔，幼蟲利用誘導抗菌防御措施，在此過程中，鞣化激素可能起著潛在的重要作用。研究棉鈴蟲鞣化激素β亞基參與脂肪組織免疫的相關功能基因表達模式。【擬解決的關鍵問題】以棉鈴蟲幼蟲作為材料，利用生物分子技術，對棉鈴蟲鞣化激素β亞基基因及其表達的burs-β同聚體蛋白進行研究，為研究其參與幼蟲生長發育提供理論基礎，為降低鱗翅目免疫及抗性、有效控制害蟲，尋找新的靶標基因提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試昆蟲

棉鈴蟲為實驗室人工飼養種群，飼養條件：溫度(26±1)℃，相對濕度65%，光周期16 L∶8 D。

1.1.2 主要試劑與儀器

鞣化激素β亞基形成的同源二聚體(Bursicon-β，Burs-β)重組蛋白為實驗室293T細胞真核表達。總RNA抽提試劑(Trizol Reagent)購自Invertrigen公司；反轉錄試劑盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit)購自TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶、限制性內切酶(BamHI、HandIII等)、pMD19-T載體、熒光定量試劑盒(SYBR Primer Script RT-PCR Kit)；DNA凝膠回收試劑盒、產物純化試劑盒和質粒提取試劑盒、IPTG(異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷)以及X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)為上海生工生物公司產品；昆蟲組織培養液(Grace’s Insect Medium，Gibco公司)；研究使用的其他試劑均為國產或進口分析純。PCR儀(Mastercycle Pro S型PCR儀購自德國Eppendorf公司)，Real time PCR儀(ABI, Carlsbad,CA美國)，超低溫離心機(Eppendorf德國Eppendorf)，紫外分光光度計(ND-2000,購自美國NanoDrop)，凝膠成像系統，恒溫培養箱，恒溫搖床等均為國產普通品牌。

1.2 方 法

1.2.1 組織樣品獲得及cDNA模板的合成

在顯微鏡下用剖鑷解剖棉鈴蟲脂肪組織(約20頭，3次重復)，立即置于Trizol試劑中，參照試劑盒說明，提取總RNA。將提取好的總RNA分別取1μL用NanoDropTM檢測，記錄各自濃度和RNA質量，保證OD260/OD280比值在1.8左右。將獲得的各樣品總RNA按照反轉錄試劑盒操作步驟合成cDNA: gDNA Eraser Buffer 2 μL, 1 μL gDNA Eraser, 1 μg不同樣品總RNA, 6 μL RNase free dH2O，組成10 μL體系，42℃反應2 min，冰上加入5×PrimeScript?Buffer 2 μL, PrimeScript?RT Enzyme MixⅠ1 μL, RT Primer Mix 1 μL, RNase free H2O 4 μL。將以上混合均勻后37℃孵育15 min，然后85℃孵育5 s，樣品在-80℃保存以備合成雙鏈RNA使用。

1.2.2 鞣化激素β亞基基因的獲得及dsRNA的合成

以前期獲得的棉鈴蟲轉錄組unigene建立本地數據庫，利用已知家蠶鞣化激素β亞基的氨基酸序列(GenBank:NP_001037289.1)，作為誘餌蛋白進行tBlastn搜索，釣取棉鈴蟲候選基因，獲得棉鈴蟲該基因cDNA序列，設計引物，引物合成均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

以棉鈴蟲cDNA 為模板，根據棉鈴蟲鞣化激素β亞基和EGFP序列設計普通PCR擴增引物和含有 T7 啟動子(斜體)序列的 RNAi 引物(表1)。合成方法參照姚雪等[15](2019)方法，首先用不含T7啟動子的引物進行第一輪PCR擴增，電泳檢測，將并PCR產物純化，切膠回收后將待干擾基因Burs-β片段與pMD19-T載體連接，對照采用實驗室保存的含有EGFP基因片段序列的表達載體pNUS-EGFPcH(質粒中EGFP的GenBank登錄號AY056838)，通過藍白斑篩選，經測序驗證正確后備用。接下來分別以含有Burs-β與EGFP目的片段的pMD19- T質粒為模板，分別以含有T7啟動子序列的Burs-β與EGFP引物進行PCR擴增，連接pMD-19T載體，通過藍白斑篩選，經測序驗證正確后作為模板，以含有T7啟動子的引物進行PCR擴增，并純化PCR產物，然后用 MEGA script RNAi Kit (ABI公司)進行體外轉錄，合成的Burs-β與EGFP dsRNA片段-20℃保存以備RNAi試驗用。表1

表1 試驗用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3Burs-β同聚體蛋白處理棉鈴蟲脂肪體引起相關免疫相關基因表達變化

根據獲得的Burs-β基因cDNA序列(未發表)設計熒光定量引物；同時根據wang等棉鈴蟲相關免疫基因序列(cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin)，設計了熒光定量引物[17-18]。

取棉鈴蟲5齡48 h幼蟲脂肪體組織，PBS清洗后放入組織培養液(Grace’s Insect Medium，Gibco公司)培養，將Burs-β同聚體重組蛋白處理體外培養的幼蟲脂肪體組織，Burs-β重組蛋白用DMSO懸浮溶解(Burs-β重組蛋白終濃度30 μg/mg組織)，處理不同時間(0.5、1和3 h)，對照用DMSO處理相同時間后分別取樣，將樣品立即置于Trizol試劑中、并迅速用液氮冷凍，提取總RNA，反轉錄。以各樣品cDNA為模版，以合成的qRT-PCR引物進行qRT-PCR檢測，18S rRNA(GenBank: KT343378)作為內參基因。qRT-PCR反應體系10 μL: SYBRPremixExTaqTM(2×)5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA模板1 μL, 無RNA酶的雙蒸水 4 μL。擴增條件: 95℃預變性3 min; 95℃變性15 s, 60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共計40個循環，各處理重復3次 。不同基因mRNA表達水平檢測采用ABI7500 qRT-PCR儀(ABI，Carlsbad，CA，美國)，以18S rRNA(GenBank：KT343378)作為內參基因。利用2-△△Ct方法分析基因轉錄的差異，△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因；△△Ct=△Ct處理-△Ct參考基因[16]。 表1

1.2.4Burs-βdsRNA干涉后棉鈴蟲幼蟲后免疫相關基因表達檢測

玻璃毛細管拉長后固定在微量注射器末端，將合成的Burs-β雙鏈RNA注射入5齡第1 d棉鈴蟲幼蟲腹足，每頭幼蟲注射Burs-βdsRNA 30 μg，對照注射相同劑量的dsEGFP，分別在注射后24、48和72 h取脂肪體組織，每組注射10頭，共3次重復，保存在400 mL Trizol中，立即用液氮冷凍后提取總RNA，反轉錄備用。根據棉鈴蟲免疫相關基因Cecropin1(GU182916.1)、cecropin2(GU182909.1)、cecropin3(GU182910.1)、attacin(AY948540.1)、cecropinD(EU041763.1)、gloverin(GU182908.1)、defensin(KT346374.1)、moricin(GU182911.1)和lebocin(KT346375.1)設計引物[17-18]。以各樣品cDNA為模版，以合成的qRT-PCR引物進行qRT-PCR檢測，PCR反應體系和方法同1.2.3，分析不同處理棉鈴蟲樣品中免疫相關基因(cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin)mRNA轉錄水平。

1.3 數據處理

數據結果參照Yue等和Du等統計學分析方法[19-20]，即取3次生物學試驗重復，誤差計算3次重復的標準差；不同時間點兩兩間的差異顯著采用獨立樣本t檢驗，不同數據間差異顯著采用單因素方程分析，數據處理首先采用DPS軟件(DPS7.05單機版)單因素方差分析(One-way analysis of variance, ANOVA)，接著進行LSD檢驗(Least Significant Difference)，P<0.001用“***”、P<0.01用“**”或大寫字母，P<0.05用*或小寫字母。

2 結果與分析

2.1 Burs- β同聚體蛋白處理棉鈴蟲脂肪體引起相關免疫相關基因表達變化

研究表明，幼蟲脂肪組織經Burs-β同聚體蛋白處理后，免疫相關基因cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin隨著時間的增加，轉錄水平具有相同的變化趨勢，即0.5內轉錄水平迅速上升，隨后在1后恢復至初始水平，在3內與初始轉錄水平亦無顯著變化。圖1

2.2 幼蟲Burs- β dsRNA合成及注射棉鈴蟲后干擾效果檢測

以棉鈴蟲cDNA 為模板，以棉鈴蟲Burs-β和EGFP普通PCR引物作為首輪擴增，測序正確后，以含有正確片段的質粒作為模板，以含有 T7 啟動子序列的 RNAi 引物，進行PCR擴增，經測序驗證正確后，利用 MEGA script RNAi Kit 試劑盒進行體外轉錄，合成Burs-β與EGFP dsRNA片段，將合成產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，Burs-β與EGFP dsRNA片段分別在質量在350 bp與520 bp ，與預測片段大小符合，dsRNA合成質量良好。

將合成好的Burs-β與EGFP dsRNA注射5齡幼蟲腹足，在注射后24、48和72 h分別取脂肪體組織，利用qRT-PCR 的方法對干涉效果進行檢測。qRT-PCR結果顯示，注射Burs-βdsRNA后，在24 與48 h，干涉效果不明顯，但在注射Burs-βdsRNA 72 h后，干涉效果極其顯著，內源性Burs-β得到干涉。圖2

圖1Burs-β同聚體蛋白處理棉鈴蟲脂肪體引起相關免疫相關基因表達變化
Fig.1 Effect ofburs-βhomomer proteins on related immune genes transcript level of fat body tissue

M，DNA mark(DL2000), 1, dsEGFP, 2 dsP burs-β

圖2 棉鈴蟲dsburs-β基因RCR檢測結果
Fig.2 PCR product ofburs-βdsRNA gene

2.3 幼蟲注射 Burs- β dsRNA對棉鈴蟲免疫相關基因轉錄水平的影響

棉鈴蟲5齡1對注射Burs-βdsRNA，72 h檢測Burs-β干涉成功后，將注射后72 h作為研究免疫基因轉錄水平變化的檢測點，對相應處理進行取樣檢測，分析棉鈴蟲免疫相關基因cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin在幼蟲體內Burs-β下調時的表達情況。qRT-PCR結果顯示，與對照轉錄水平相比，cecropin1在干涉后72 h顯著降低(P=0.001 7)；免疫相關基因cecropin2在72 h后轉錄水平也有相應程度下調，與對照處理差異顯著(P=0.040 5)；免疫基因cecropin3在72 h后與對照相比顯著下調(P=0.008 8)；免疫基因attacin在72 h與對照相比差異顯著(P=0.008 1)； 免疫基因cecropinD在72 h后轉錄水平與對照相比差異顯著(P=0.048 3)；免疫基因gloverin在72 h后與對照相比下調顯著，達到極顯著差異(P=0.000 2)；免疫基因defensin在72 h后轉錄水平也有相應程度下調，與對照處理差異顯著(P<0.004 9)；免疫基因moricin在72 h后轉錄水平也有相應程度下調，與對照處理差異不顯著(P<0.058 2)；免疫基因lebocin在72 h后轉錄水平也有相應程度下調，與對照處理差異顯著(P<0.045 5)。圖3，圖4

圖3Burs-βdsRNA注射幼蟲后不同時間內干擾效果檢測
Fig.3 Effect ofburs-βexpression level ofHelicoverpaarmigeraafter treatment withburs-βdsRNA at different times

圖4 5齡幼蟲注射burs-βdsRNA 72 h后棉鈴蟲免疫相關基因轉錄水平變化
Fig.4 Related immune genes transcript level of fat body tissue in 5thlarval instar after 72 h injection withburs-βdsRNA

3 討 論

以棉鈴蟲為研究對象，以實驗室保存的形成的同源二聚體為外源激素，體外處理棉鈴蟲5齡幼蟲脂肪體組織，發現處理后棉鈴蟲脂肪體內免疫相關基因cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin在0.5 h內轉錄水平迅速上升，隨后恢復處理前轉錄水平。為驗證Burs-β重組蛋白體外處理幼蟲脂肪體引起的相關免疫基因變化等現象，并探究這種轉錄水平上變化是否是因該激素直接引起，接下來體外合成了burs-β雙鏈RNA，注射幼蟲腹足，在確保72 h后幼蟲體內Burs-βmRNA因降解而下調后，利用qRT-PCR分別檢測了脂肪組織中cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin、moricin和lebocin表達水平。結果發現cecropin1、cecropin2、cecropin3、attacin、cecropinD、gloverin、defensin和lebocin轉錄水平隨著Burs-βmRNA干擾下調而顯著下降，而moricin變化并不顯著。結果表明，一定濃度鞣化激素的刺激激活了免疫相關基因的迅速響應與高水平表達。而當鞣化激素水平相對較低時，大部分免疫相關基因響應該激素的影響而降低表達水平，表明Burs-β的沉默能夠顯著抑制棉鈴蟲幼蟲體內部分免疫相關基因的表達。

鞣化激素有α同源二聚體、β同源二聚體和β異源二聚體，除了其在表皮鞣化和翅的伸展方面的典型功能之外，組成鞣化激素的每個亞基還具有各自獨立的功能與作用[4,22]。Zhang 等[21]發現在埃及伊蚊Aedesaegypti中，鞣化激素通過其受體 Relish2 誘導抗菌肽基因的表達，從而有效地抑制體外細菌的生長，起到預防性免疫作用。也有研究表明，Burs-β組成的同源二聚體經由 IMD 路徑，通過激活轉錄因子Relish，調控免疫反應。但其同源二聚體可能是通過新的受體來調控抗菌肽的表達[4]。

昆蟲體內，抗菌肽主要由脂肪體和血細胞合成，在其他部位也有少量的合成[22]，以幼蟲脂肪體為研究對象，在取樣以及快速研究抗菌肽在轉錄水平上受鞣化激素影響方面提供了較為快捷的便利。

4 結 論

鞣化激素Burs-β組成的同源二聚體體外處理棉鈴蟲幼蟲脂肪組織激活了免疫相關基因的迅速響應與過量表達。而利用RNAi技術注射幼蟲活體，當鞣化激素基因轉錄由于干擾受到抑制、激素水平相對較低時，大部分免疫相關基因響應該激素的刺激而降低各自表達水平，Burs-β的沉默能夠顯著抑制棉鈴蟲幼蟲體內部分免疫相關基因的表達。