11種植物精油對(duì)2種棉花病原菌的抑菌活性

趙娜娜，盧若濱，加米古麗·木斯?fàn)柡梗惾痃鳎瑮钗念＃?悅，路 偉

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明 650201)

0 引 言

【研究意義】新疆是我國(guó)最大的優(yōu)質(zhì)棉生產(chǎn)基地，棉花生產(chǎn)面積、單產(chǎn)和調(diào)出量連續(xù)24年位居全國(guó)之首，2017年新疆棉花播種面積228.11×104hm2，其種植面積約占全國(guó)種植面積的70%以上[1]。在棉花生長(zhǎng)期會(huì)發(fā)生多種病害，造成籽棉產(chǎn)量損失和質(zhì)量下降，使得其經(jīng)濟(jì)價(jià)值大大降低。其中，串珠鐮刀菌引起的棉花紅腐病是一種危害較大的苗期病害，主要引起棉花種子腐爛、根部腐爛、芽部腐爛和莖基腐爛[2]。目前對(duì)棉花紅腐病、棉花枯萎病的防治采用綜合治理的策略與方法，化學(xué)防治因具有見效快、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，仍是目前病害控制的有效途徑。隨著化學(xué)藥劑使用年限的增加，植物病原真菌對(duì)殺菌劑的抗性變得越來越明顯，兼之棉田連作，使得化學(xué)防效越來越差，棉花病害的發(fā)生呈現(xiàn)日益加重的趨勢(shì)，亟需尋找新型綠色環(huán)保替代藥劑。【前人研究進(jìn)展】近年來隨著轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的推廣種植，此病的發(fā)生危害逐漸加劇，給棉花生產(chǎn)帶來較大的挑戰(zhàn)，嚴(yán)重影響新疆經(jīng)濟(jì)發(fā)展[3]。尖孢鐮刀菌(萎蔫專化型)引起的棉花枯萎病是棉花成株期主要病害之一，對(duì)棉花的維管束等部位造成危害，導(dǎo)致葉片枯死或脫落，棉花枯萎病作為土傳病害是制約棉花產(chǎn)量的重要因素之一，每年給棉花帶來的經(jīng)濟(jì)損失在5%～30%，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)，甚至可以造成絕產(chǎn)[4]。【本研究切入點(diǎn)】植物精油是從植物中萃取的特有芳香物質(zhì)，由多種化合物共同組成，成分復(fù)雜，主要成分為萜烯、倍半萜烯及其氧化物，此外還有醛、酮、酯、酸等，其中具有抗真菌活性的為醛類、醇和酚類化合物[5]。據(jù)文獻(xiàn)研究表明，大蒜、丁香、肉桂等香辛料精油在殺菌劑方面具有較大的應(yīng)用潛力[6, 7]。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過水蒸氣蒸餾法提取11種香辛料植物的精油，采用生長(zhǎng)速率抑制法測(cè)定精油對(duì)尖孢鐮刀菌萎蔫專化型、串珠鐮刀菌的抑制活性，評(píng)價(jià)11種香料植物精油對(duì)棉花枯萎病病菌、棉花紅腐病病菌的生物活性，為植物源殺菌劑的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 香料植物

11種香料植物購(gòu)買于新疆烏魯木齊市北園春菜市場(chǎng)，植物標(biāo)本均保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院天然產(chǎn)物與化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。表1

表1 11種植物采集名錄Table 1 11 plants directory

1.1.2 棉花病原菌

供試菌：尖孢鐮刀菌萎蔫專化型(Fusariumoxysporumf.sp. vasinfectum)和串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)分離自發(fā)病棉花，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，菌種現(xiàn)保存于該實(shí)驗(yàn)室。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基( PDA) ：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 試劑與儀器

儀器：連續(xù)蒸餾裝置，北京玻璃儀器廠；DZTW型調(diào)溫電熱套，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；SHZ-DIII循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器有限責(zé)任公司；RE-52CS型號(hào)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司； LE204E電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；PQX-280B-22H人工氣候箱，寧波萊福科技有限公司。

化學(xué)試劑：正己烷、無水硫酸鈉(分析純)均購(gòu)自天津化學(xué)試劑公司。

1.2 方 法

1.2.1 植物精油的提取

植物材料：市場(chǎng)購(gòu)買荊芥、大蒜、香葉、八角、茴香、孜然、花椒、青花椒、桂皮、丁香和黑胡椒各3 kg。

將適量植物材料放入到3 000 mL的圓底燒瓶中，加1 500 mL水，用水蒸氣蒸餾法蒸餾6 h，所得油水混合物用正己烷萃取，萃取所得物用無水硫酸鈉脫水后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)濃縮(40℃)，回收正己烷，所得殘留的油狀液即為精油，測(cè)比重，放入棕色瓶中密封保存，置于4℃冰箱中備用。

1.2.2 生長(zhǎng)速率抑制法測(cè)定植物精油的抑菌活性

用瓊脂稀釋法結(jié)合菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定精油的抑菌活性。用正己烷將11種精油分別稀釋成50 和5 μL/mL 2個(gè)濃度，用移液槍吸取0.5 mL已稀釋的精油溶液加入49.5 mL PDA 培養(yǎng)基中混勻，1 mL培養(yǎng)基中分別含有0.5、0.05 mg植物精油，將培養(yǎng)基倒入直徑90 mm的培養(yǎng)皿，倒3皿。選擇事先培養(yǎng)好的生長(zhǎng)均勻的病原菌菌落，沿其邊緣用打孔器打直徑5 mm的菌餅。待含精油的培養(yǎng)基凝固后將5 mm的菌餅置于培養(yǎng)基中心。對(duì)照加0. 5 mL的正己烷代替精油溶液。將培養(yǎng)皿放置于溫度為25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～9 d，待對(duì)照快要長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)用十字交叉法測(cè)量菌落直徑( mm) ，取平均值，重復(fù)3 次。

1.2.3 測(cè)定活性精油的EC50

選取抑菌活性較好的精油，分別稀釋成系列濃度梯度的含藥培養(yǎng)基，測(cè)定不同質(zhì)量濃度精油的抑菌活性，計(jì)算精油菌絲生長(zhǎng)的抑制率，并根據(jù)幾率值分析法求毒力回歸方程和有效中濃度(EC50)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 和SPSS 19. 00 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，按照式(1)計(jì)算相對(duì)抑制率。

相對(duì)抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-5)×100%。

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 11種植物精油對(duì)尖孢鐮刀菌(萎蔫專化型)的抑菌活性

研究表明，在質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)，肉桂油和大蒜油的抑菌活性高達(dá)100%，荊芥油的抑菌活性也較高，為95.56%；其次為八角油和丁香油，抑菌活性分別83.06%和80.86%。在質(zhì)量濃度為0.05 g /L 時(shí)，孜然油抑菌活性最高，為28.01%，其次為大蒜油，抑菌活性為25.56%，稍弱的是肉桂油、丁香油和八角油，抑菌活性分別為20.89%、20.88%和20.80%，三者之間無顯著差異。除月桂、黑胡椒、茴香、花椒之外，剩余7種植物精油對(duì)尖孢鐮刀菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性，其中肉桂油、大蒜油的活性最好，荊芥油、八角油和丁香油次之。 表2

表2 11種植物精油對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌活性Table 2 Fungicidal activity of 11 essential oils against F. oxysporum

注: 數(shù)據(jù)后的不同小寫字母表示在方差分析( Duncan 新復(fù)極差法) 中于0. 05 水平上差異顯著
Note：Data were presented as mean±SD, data with different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level

2.2 11種植物精油對(duì)串珠鐮刀菌的抑菌活性

研究表明，在質(zhì)量濃度為0.5 g /L時(shí)，肉桂油和丁香油的抑菌活性高達(dá)100%，其次為大蒜油、荊芥油和花椒油，抑菌活性分別為93.99%、92.31%和92.31%。在質(zhì)量濃度為0.05 g/L 時(shí)，大蒜油抑菌活性最高，為36.22%，其次為茴香油，抑菌活性為25.44%，稍弱的是荊芥油和花椒油，抑菌活性分別為23.20%、23.20%，二者之間無顯著差異。結(jié)果表明,肉桂、丁香、大蒜、荊芥、花椒、孜然6種植物精油對(duì)串珠鐮刀菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性，其中肉桂油、丁香油的活性最好，大蒜油、荊芥油、花椒油和孜然油次之。 表3

2.3 4種活性精油對(duì)尖孢鐮刀菌的EC50

生長(zhǎng)速率法測(cè)定4種植物精油對(duì)尖孢鐮刀菌的EC50值，研究表明，肉桂、大蒜、荊芥和孜然的EC50值均在110 mg /L 以下，分別為22.89、51.33、79.71 和101.97 mg /L，4種植物精油對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌活性較好，尤其是肉桂油，活性最強(qiáng)。表4

2.4 3種活性精油對(duì)串珠鐮刀菌的EC50

生長(zhǎng)速率法測(cè)定3種植物精油對(duì)串珠鐮刀菌的EC50值，研究表明，肉桂、大蒜和丁香的EC50值均在150 mg /L 以下，分別為8 315、123.33和99.20 mg /L，3種植物精油對(duì)串珠鐮刀菌的抑菌活性較好，尤其是肉桂油，活性最強(qiáng)。表5

表3 11種植物精油對(duì)串珠鐮刀菌的抑菌活性Table 3 Fungicidal activity of 11 essential oils against F. moniliforme

注: 數(shù)據(jù)后的不同小寫字母表示在方差分析( Duncan 新復(fù)極差法) 中于0.05 水平上差異顯著
Note：Data were presented as mean±SD, data with different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level

表4 4種高活性植物精油對(duì)尖孢鐮刀菌的EC50值Table 4 EC50 value toxicity test of 4 essential oils against F. oxysporum

表5 3種高活性植物精油對(duì)串珠鐮刀菌的EC50值Table 5 EC50 value toxicity test of 3 essential oils against F. moniliforme

3 討 論

近年來，植物源殺菌劑的開發(fā)和研究引起了許多研究者的關(guān)注，已成為農(nóng)藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[8]，由于植物源殺菌劑來源于植物體，除具有無污染、不殺傷靶標(biāo)生物、不殘留、不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，還能修復(fù)傷口、營(yíng)養(yǎng)復(fù)壯、提高作物免疫力[9]，因此，從植物中尋找抑菌活性物質(zhì)仍然是近幾年來開發(fā)研制新型殺菌劑的熱點(diǎn)之一。

八角、茴香、大蒜等除了作為調(diào)料調(diào)劑食物的味道，還具有殺菌活性。如青花椒油能有效抑制白地霉、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)朊假絲酵母、煙曲霉、熱帶假絲酵母、黑曲霉和大腸桿菌等菌絲的生長(zhǎng)[10]；粉紅單端孢、鏈格孢菌、青霉、大腸桿菌、熒光假單孢菌和枯草芽孢桿菌等病原菌在含有丁香、孜然和肉桂精油的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較弱[11]；月桂精油與肉桂精油對(duì)終極腐霉、6種病原真菌：灰葡萄孢、茄鐮孢菌、瓜果腐霉以及禾谷鐮孢菌5種病原真菌均具有一定的抑制效果[12]；八角與茴香精油能抑制酵母菌、枯草芽孢桿菌、金葡菌與大腸桿菌4種病原菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量[13]；在對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肉桂、黑胡椒與茴香精油對(duì)其有抑制效果[14]，黑胡椒精油對(duì)5種病原菌：西瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、梨黑斑病菌、小麥赤霉病菌與番茄灰霉病菌具有一定的抑制作用[15]；大蒜精油對(duì)8種病原菌：表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、綠膿桿菌、白色念珠菌和黑曲霉均具有一定的抑制作用，甚至對(duì)白色念珠菌、黑曲霉和表皮葡萄球菌具有一定的致死作用[16]。

但香辛料植物多應(yīng)用在食品和醫(yī)藥上，僅有少數(shù)文獻(xiàn)研究了植物精油對(duì)植物病害的抑菌研究。所以，研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了11種精油對(duì)4種植物病原真菌的抑制活性。在質(zhì)量濃度為0.5 g /L時(shí)，11種植物精油均對(duì)棉花枯萎病具有一定的抑制作用，肉桂油和大蒜油的抑菌活性高達(dá)100%，荊芥油和孜然油的抑菌活性也較高，EC50值較低，活性好于其余7種精油，目前，在棉花枯萎病的生物防治方面，前人通過生防菌防治棉花枯萎病從而降低其病情指數(shù)和發(fā)病率[17]，但并未出現(xiàn)用植物精油防治的案例，具體防治效果還需進(jìn)一步研究。在質(zhì)量濃度為0.5 g /L時(shí)，11種植物精油均對(duì)棉花紅腐病具有一定的抑制作用，肉桂油和丁香油的抑菌活性高達(dá)100%，其次為大蒜油、荊芥油和花椒油，在質(zhì)量濃度為0.05 g /L 時(shí)，大蒜油抑菌活性最高。肉桂、大蒜和丁香的EC50值均在150 mg /L 以下，與已有藥劑相比，雖不如40%甲基托布津膠懸劑(EC50值為43.40 mg /L)，但好于40%硫磺膠懸劑(EC50值為184.44 mg /L)[18]，表明3種植物精油的抑菌活性較好，具有開發(fā)為天然殺菌劑的潛力，為殺菌劑開發(fā)應(yīng)用提供有效的抑菌成分，

植物精油組成成分復(fù)雜，包含有幾十種化合物，但其主要成分以萜烯及其氧化物和倍半萜烯為主，此外還有酯、酸、醛、酮等[19, 20]，化學(xué)成分復(fù)雜，究竟是哪一種化學(xué)成分具有抑菌活性并不清楚。且由于植物精油是一種混合物，可以活性追蹤為指導(dǎo)對(duì)精油進(jìn)行分離純化，找出抑制4種病原真菌的關(guān)鍵活性成分。關(guān)鍵活性成分可作為先導(dǎo)化合物，以其為模板合成新型殺菌劑，為植物病害的生物防治提供新型藥劑，新殺菌劑因來源于自然，減緩抗藥性的產(chǎn)生。

4 結(jié) 論

肉桂油、大蒜油、荊芥油3種精油對(duì)尖孢鐮刀菌(萎蔫專化型)、串珠鐮刀菌均有較好的抑菌效果，孜然油對(duì)尖孢鐮刀菌(萎蔫專化型)有較好的抑菌效果，丁香油對(duì)串珠鐮刀菌有較好的抑菌效果，5種高活性植物精油具有開發(fā)為天然殺菌劑的潛力。