Bmal1低表達對胰島β細胞功能的影響

葉綠　吳華香　許偉紅

摘要：目的? 研究生物鐘基因芳香烴受體核轉位蛋白樣1基因（Bmal1）低表達對大鼠胰島細胞瘤細胞-1（INS-1）功能的影響。方法? 應用大鼠胰島β細胞系INS-1細胞，隨機將INS-1細胞分為空白組、陰性對照組和Bmal1 siRNA組，通過RNA干擾技術沉默Bmal1，比較三組細胞內活性氧（ROS）水平、胰島素（GSIS）含量、核因子E2相關因子2（Nrf2）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）mRNA表達，并采用透射電鏡觀察線粒體結構變化。結果? 陰性對照組與空白組ROS水平、GSIS含量、Nrf2、CAT、GSH-Px mRNA表達比較，差異無統計學意義（P>0.05）;Bmal1 siRNA組ROS水平、Nrf2表達高于陰性對照組，GSIS含量、CAT、GSH-Px mRNA表達低于陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。透射電鏡結果顯示，在空白組和陰性對照組中線粒體為圓形或橢圓形，具有完整的膜和少量管狀嵴;Bmal1 siRNA組中線粒體腫脹、形狀不規則，線粒體嵴斷裂和消失。結論? Bmal1低表達可導致β細胞氧化應激增強，GSIS下降，其作用機制可能與影響Nrf2信號通路有關。

關鍵詞：芳香烴受體核轉位蛋白樣1基因;β細胞;核因子E2相關因子2;氧化應激

中圖分類號：R733.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.03.020

文章編號：1006-1959（2020）03-0066-03

Effect of Bmal1 Supression on Pancreatic β-Cell Function

YE Lyu，WU Hua-xiang，XU Wei-hong

（Department of Rheumatology， School of Medicine， The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University，

Hangzhou 310009， China）

Abstract：Objective? To investigate the effect of brain and muscle arnt-like 1 （Bmal1） on the function of insulinoma cell line （INS-1 cells）.Methods? INS-1 cells were randomly divided into blank control group， negative control group and Bmal1 siRNA group. Bmal1 was silenced by RNA interference technology， and the intracellular reactive oxygen species （ROS） levels， glucose-stimulated insulin secretion （GSIS）， nuclear factor erythroid-2 related factor 2 （Nrf2）， catalase （CAT） and glutathione peroxidase （GSH-Px） mRNA expressions were compared in the three groups. Mitochondrial morphological changes were observed by transmission electron microscopy.Results? There was no significant difference in the ROS level， GSIS， Nrf2， CAT， GSH-Px mRNA expression between the negative control group and the blank group （P>0.05）. The Bmal1 siRNA group had higher ROS levels and Nrf2 expression than the negative control group， and the GSIS， CAT， and GSH-Px mRNA expression were lower than the negative control group. The differences were statistically significant （P<0.05）. Transmission electron microscopy results showed that the mitochondria were round or oval in the blank group and the negative control group， with a complete membrane and a few cristae. In the Bmal1 siRNA group， the mitochondria were swollen with irregular shape， and the mitochondrial cristae were fragmented and disappeared. Conclusion? Bmal1 inhibition can lead to increased oxidative stress in β-cell and decreased GSIS via Nrf2 signaling pathway.

Key words：Brain and muscle arnt-like 1;Pancreatic β-cell;Nuclear factor erythroid-2 related factor;Oxidative stress

生物鐘調控哺乳動物的生理、能量代謝和行為活動的晝夜節律。時鐘系統由位于下丘腦視交叉上核的中樞生物鐘以及外周組織的外周生物鐘組成[1]，其運行受正向調控成員芳香烴受體核轉位蛋白樣1基因（Bmal1）和時鐘基因與反向調控成員（周期基因1、周期基因2、隱色素基因1和隱色素基因2）構成反饋回路控制[2]。Bmal1是生物鐘基因最重要成員之一，而生物鐘基因異常與糖尿病的發病密切相關[3，4]，動物實驗已證實[5]，敲除小鼠β細胞Bmal1基因后，小鼠代謝功能紊亂，導致高血糖和低胰島素血癥。然而，目前對Bmal1調控胰島β細胞功能的分子機制了解較少。此外，β細胞功能障礙在糖尿病發病中起關鍵作用，其中氧化應激是導致β細胞功能障礙的主要原因之一[6]。氧化應激時，活性氧（ROS）生成過多，抗氧化系統[核因子E2相關因子2（Nrf2）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）][7]和氧化系統失衡，導致組織細胞損傷。而研究Bmal1是否參與調節β細胞的氧化應激反應，有助于進一步了解糖尿病的發病機制。本研究應用大鼠胰島β細胞系INS-1細胞，通過RNA干擾技術沉默Bmal1，探討Bmal1對β細胞功能的作用，現報道如下。

1材料和方法

1.1實驗細胞? 大鼠胰島細胞瘤細胞-1（INS-1）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2試劑? 胎牛血清、巰基乙醇、左旋谷氨酰胺、HEPES、青霉素-鏈霉素溶液和RPMI-1640培養液（美國Gibco公司），LipofectamineTM 2000（美國Invitrogen公司）、RNA提取試劑盒（美國Ambion公司），PCR試劑盒（美國Vazyme公司）。

1.3細胞培養? INS-1細胞的培養條件為含10%胎牛血清、50 μmol/L巰基乙醇、2 mmol/L左旋谷氨酰胺、10 mmol/L HEPES和11.2 mmol/L葡萄糖的RPMI-1640培養液，置于含5% CO2的37℃培養箱中進行培養。細胞隨機分為空白組、陰性對照組和Bmal1 siRNA組。

1.4細胞轉染? 將處于對數生長期的INS-1細胞按照每孔2×105個細胞數接種于細胞培養6孔板培養過夜。轉染前換成無血清1640培養基，顯微鏡下觀察細胞，當細胞密度達到70%時使用LipofectamineTM 2000試劑進行轉染，轉染步驟參考試劑說明書進行。轉染24 h后，加入5.5 mmol/L的葡萄糖，繼續培養24 h后收集細胞。

1.5流式細胞術檢測細胞內ROS水平? 按照ROS檢測試劑盒說明書檢測細胞內ROS水平：加入1 ml DCFH-DA，37℃避光孵育20 min，每隔3 min混勻一下。使用無血清細胞培養液洗滌細胞3次。收集細胞用流式細胞儀進行檢測熒光強度差異，激發波長為488 nm，發射波長為530 nm。

1.6胰島素分泌測定? 細胞經轉染等處理后，將細胞培養液換為含2.8 mmol/L葡萄糖的KHB緩沖液37℃孵育1 h;用KHB緩沖液洗細胞3次，然后分別用含2.8 mmol/L和16.7 mmol/L葡萄糖的KHB緩沖液37℃孵育細胞1 h，收集上清，檢測胰島素含量。

1.7實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測Nrf2、CAT、GSH-Px mRNA的表達? 用Trizol法提取各組細胞的總RNA。按試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。反轉錄條件：25℃ 5 min，50℃ 15 min，85℃ 5 min，4℃ 10 min。PCR擴增條件：95℃預變性10 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，循環40次。根據2-ΔΔCt法，以GAPDH為內參，計算Nrf2、CAT、GSH-Px基因相對表達水平。實驗所有引物序列均由杭州擎科生物公司合成。

1.8透射電鏡觀察線粒體結構? 樣品用2.5%戊二醛固定2 h，然后用鋨酸固定2 h。隨后將樣品在乙醇和丙酮中脫水并包埋在SPI-Pon-812中。使用切片機將切片切成0.1 mm厚度，隨后用檸檬酸鉛和醋酸鈾染色，最后通過HT7700-SS電子顯微鏡進行觀察。

1.9統計學方法? 采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析。計量資料以（x±s）表示，多組間比較使用單因素方差檢驗，組間兩兩比較使用t檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1三組ROS水平比較? 陰性對照組與空白組ROS水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）;Bmal1 siRNA組ROS水平高于陰性對照組（P<0.05），見圖1。

2.2三組GSIS含量比較? 陰性對照組與空白組GSIS含量比較，差異無統計學意義（P>0.05）;Bmal1 siRNA組GSIS含量低于陰性對照組（P<0.05），見圖2。

2.3三組Nrf2、CAT、GSH-Px mRNA表達比較? 陰性對照組與空白組Nrf2、CAT、GSH-Px mRNA表達比較，差異無統計學意義（P>0.05）。Bmal1 siRNA組Nrf2表達高于陰性對照組，CAT、GSH-Px mRNA表達低于陰性對照組（P<0.05），見圖3。

2.4三組胰島β細胞線粒體結構比較? 在空白組和陰性對照組中，線粒體為圓形或橢圓形，具有完整的膜和少量管狀嵴;Bmal1 siRNA組中線粒體腫脹，形狀不規則，線粒體嵴斷裂和消失，見圖4。

3討論

人體多種生理、代謝過程由生物鐘調控，具有晝夜節律性[8]。生物鐘基因在糖尿病發病中具有重要作用。胰島β細胞功能衰竭是糖尿病發病的關鍵環節，氧化應激是引起β細胞功能受損的主要機制之一。但目前關于Bmal1對胰島β細胞作用的研究較少，其生物鐘基因Bmal1是否通過抗氧化系統調控β細胞功能尚不明確。

研究發現[9]，糖尿病患者體內氧化應激增強，β細胞內抗氧化酶含量減少，抗氧化能力低于其他組織，從而對氧化應激損傷較為敏感。當糖尿病患者ROS水平升高時，可能會引起胰島β細胞GSIS功能受損[10]。本研究結果發現，陰性對照組與空白組ROS水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）;Bmal1 siRNA組ROS水平高于陰性對照組、GSIS低于陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.05），說明抑制Bmal1表達后，INS-1細胞中ROS水平增加，GSIS下降。線粒體是細胞能量代謝中心，ROS產生的主要部位，線粒體損傷引起的ATP合成減少以及氧化應激產物積聚可進一步導致細胞損傷和凋亡。本研究中Bmal1 siRNA組透射電鏡結果顯示，抑制Bmal1表達后，β細胞表現出線粒體腫脹，線粒體嵴斷裂和消失，提示氧化應激是Bmal1基因異常導致β細胞功能損傷的重要機制之一。

Nrf2是內源性抗氧化應激的關鍵轉錄因子，通過調節多種抗氧化基因功能（CAT、GSH-Px、血紅素氧化酶-1、超氧化物歧化酶等）在抗氧化、抗凋亡等方面起著重要作用。Nrf2信號通路活化可減輕氧化應激對細胞的損傷作用。激活Nrf2可減輕高糖誘導的內皮細胞損傷[11]，反之，抑制Nrf2加重高糖誘導的心肌細胞損傷[7]。本研究發現，陰性對照組與空白組Nrf2、CAT、GSH-Px mRNA表達比較，差異無統計學意義（P>0.05）。Bmal1 siRNA組Nrf2表達高于陰性對照組，CAT、GSH-Px mRNA表達低于陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.05），說明抑制Bmal1基因后，Nrf2 mRNA表達增加，但CAT、GSH-Px mRNA表達下降，提示抑制Bmal1基因導致高水平的氧化應激狀態，超出細胞對氧化物的抗氧化能力，使得抗氧化系統紊亂，導致細胞氧化應激損傷。

綜上所述，Bmal1低表達可導致β細胞氧化應激增強，GSIS下降，其作用機制可能與影響Nrf2信號通路有關。

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收稿日期：2019-12-11;修回日期：2019-12-21

編輯/杜帆