冬棗新病害匍柄霉葉斑病病原菌的分離鑒定

雷早娟 武亞明 安鵬天

摘要 ? ?從冬棗葉斑病的樣品上分離到菌株L3-1-1，依據(jù)其形態(tài)學(xué)特征、rDNA-ITS序列分析結(jié)果以及致病性試驗，將其鑒定為匍柄霉屬真菌，能導(dǎo)致冬棗匍柄霉葉斑病。

關(guān)鍵詞 ? ?匍柄霉屬;形態(tài)學(xué);ITS基因

中圖分類號 ? ?S436.65 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）04-0099-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

Abstract ? ?A fungus L3-1-1 was isolated from the pathogenic leaves of Dongzao jujube，and identified as Stemphylium sp. according to the morphological characteristics of the colony，ITS sequence and pathogenicity test results.L3-1-1 can cause leaf spot disease of Dongzao jujube.

Key words ? ?Stemphylium Wallroth;morphology;ITS gene

冬棗又名蘋果棗，屬于鼠李科棗屬，含有19種氨基酸及多種維生素，營養(yǎng)價值豐富，是一種受人青睞的果品，市場前景廣闊[1]。隨著人們消費觀念的轉(zhuǎn)變，國內(nèi)外對冬棗的需求日漸增加，冬棗的種植面積和發(fā)展規(guī)模不斷擴(kuò)大。與此同時，其生態(tài)環(huán)境發(fā)生了改變，隨之也出現(xiàn)了許多問題，其中最嚴(yán)重的是病蟲害。

匍柄霉屬真菌是一類常見真菌，可引起多種植物病害。截至目前，世界上已報道有150種匍柄霉屬病原菌，我國記載的有40種以上[2]。本文對冬棗新病害匍柄霉葉斑病病原菌進(jìn)行分離鑒定，以期為匍柄霉葉斑病的科學(xué)防治提供參考。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

冬棗匍柄霉葉斑病病樣，于2019年6月采自河北省黃驊市冬棗大棚;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

1.2 ? ?試驗方法

1.2.1 ? ?冬棗匍柄霉葉斑病的癥狀觀察。采集發(fā)病冬棗葉片進(jìn)行觀察，詳細(xì)記錄并描述病斑大小、形狀、顏色、危害部位等。

1.2.2 ? ?病原物的分離與培養(yǎng)。釆用組織分離法，將病葉病健交界處剪成小塊兒表面消毒后放于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，等到組織塊兒周圍有菌絲產(chǎn)生后，將菌絲挑到新的PDA培養(yǎng)基上，得到純化的分離物。

1.2.3 ? ?病原菌形態(tài)學(xué)觀察。定期觀察該菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形狀、顏色、生長速度等;將病原菌從培養(yǎng)基上刮下，并制成臨時玻片，放置于在生物顯微鏡下觀察記錄病原菌的菌絲、分生孢子等形態(tài)，并測量大小。

1.2.4 ? ?致病性試驗。將病原菌在PDA上培養(yǎng)7 d后，用無菌水制成菌體懸浮液，采用離體葉片穿刺接種方法進(jìn)行致病性驗證。用消毒后的解剖針穿刺冬棗葉片，然后在穿孔上滴上孢子懸浮液，以無菌水作對照。設(shè)3個重復(fù)，然后在28 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)24 h[3]，7d內(nèi)觀察記錄發(fā)病癥狀，對出現(xiàn)典型癥狀的葉片再次進(jìn)行病原菌分離。

1.2.5 ? ?PCR擴(kuò)增和序列分析。將分離菌株在PDA上培養(yǎng)7 d后，用消毒后的接種針刮取0.5 g菌絲體置于離心管中備用?；蚪MDNA通過試劑盒法提取。分別使用ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）引物對分離物的rDNA-ITS基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠跑電泳后測序。PCR產(chǎn)物送天津金唯智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。所得序列進(jìn)行校正拼接后與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對，并采用MEGA 7.0.14軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[4]。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?冬棗匍柄霉葉斑病癥狀

試驗結(jié)果表明，冬棗匍柄霉葉斑病對冬棗新葉和老葉均可造成危害，從冬棗葉尖開始侵染并發(fā)病，形成褐色不規(guī)則形的病斑（圖1），使冬棗葉片從頂端開始脫水壞死，后期干枯脫落。

2.2 ? ?病原菌形態(tài)學(xué)特征

分離物L(fēng)3-1-1在PDA培養(yǎng)基上生長較慢。菌落較厚，呈地毯狀生長，圓形，中央、邊緣分別呈現(xiàn)灰色、白色，邊緣不整齊，背面中央黑褐色，邊緣淺褐色。菌絲呈叉狀分枝，有分隔，淡褐色，光滑（圖2）。

2.3 ? ?致病性測定

接菌7 d后，冬棗葉片上出現(xiàn)褐色圓形病斑，葉片背面病斑顏色稍淺，病斑易破裂。對照組未見發(fā)?。▓D3）。對接種后的病斑再次進(jìn)行病原菌分離，得到和原分離菌株一致的病原菌[5-6]。根據(jù)柯赫氏法則，證明接種菌株為冬棗匍柄霉葉斑病病原菌。

2.4 ? ?ITS序列分析

利用rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4對分離物L(fēng)3-1-1的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送天津金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序，校正拼接后獲得565 bp的序列。序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對分析，結(jié)果顯示，分離物L(fēng)3-1-1與Stemphylium sp.（LC317797.1）序列的相似性為100%，采用MEGA 7.0.14軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)分離物L(fēng)3-1-1與Stemphylium sp.在同一個分支，且Bootstrap支持率為100%（圖4）。說明該分離物為匍柄霉屬真菌。

3 ? ?結(jié)論與討論

匍柄霉屬真菌在蔬菜上造成危害的報道較常見，尤其是2002年以來，匍柄霉屬真菌危害作物的報道日益增多。杜公福等[2]于2013年報道了萵苣、菜豆、茄子、苦瓜、菠菜等多種海南省冬季北運蔬菜的匍柄霉葉斑病。薛峰[5]、張?zhí)煊頪6]陸續(xù)報道了匍柄霉屬的中國新種及新記錄種。

本研究結(jié)果可為診斷、了解匍柄霉葉斑病的發(fā)生規(guī)律以及病害防治等提供一定的參考。由于各種原因，本文未觀察到分離物L(fēng)3-1-1產(chǎn)生的孢子，故不能結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定到種，后期還將繼續(xù)研究誘導(dǎo)其產(chǎn)孢的方法，努力將其鑒定到種。需注意的是，本病害在實際生產(chǎn)中很容易被認(rèn)為是干旱缺水導(dǎo)致的葉尖枯萎的生理性病害。

4 ? ?參考文獻(xiàn)

[1] 孫蕾，王太明，鮑曉明，等.冬棗漿胞病病原微生物的分離與鑒定[J].山東林業(yè)科技，2010，40（5）：14-19.

[2] 杜公福，周艷芳，石延霞，等.海南省冬季北運蔬菜匍柄霉葉斑病病原的鑒定[J].植物保護(hù)，2013，39（2）：122-127.

[3] 方仲達(dá).植病研究方法[M].3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[4] 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建方法[J].微生物學(xué)報，2012，52（10）：1296.

[5] 薛峰.暗色絲孢真菌細(xì)基格孢屬（Ulocladium）、葡柄霉屬（Stemph-ylium）及鏈格孢屬（Alternaria）的分類和分子系統(tǒng)學(xué)研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[6] 張?zhí)煊?中國真菌志·第三十一卷·暗色磚格分生孢子真菌26屬（鏈格孢屬除外）[M].北京：科學(xué)出版社，2009.