七葉皂苷鈉對(duì)小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎作用研究

王大貴 李梅 李竣

【摘 要】 目的：研究七葉皂苷鈉對(duì)小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎（ACD）的治療作用。方法：60只SPF級(jí)昆明小鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、七葉皂苷鈉（SA）低、中、高劑量組（1.8、3.6、7.2mg/kg），每組10只。用2，4-二硝基氯苯（DNCB）致敏和激發(fā)建立小鼠ACD模型，以小鼠耳部耳廓腫脹度、脾指數(shù)和組織病理學(xué)檢查為評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果：七葉皂苷鈉能夠減輕小鼠腹部皮損炎癥情況，抑制小鼠耳廓腫脹增加，降低小鼠脾指數(shù)。隨著SA濃度的增加，真皮層細(xì)胞水腫變性得到緩解，組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。結(jié)論：七葉皂苷鈉對(duì)小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎具有一定的治療作用，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

【關(guān)鍵詞】 七葉皂苷鈉;變應(yīng)性接觸性皮炎;七葉樹(shù)

【中圖分類號(hào)】R285.5 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號(hào)】1007-8517（2020）1-0008-05

Abstract：Objective To study the therapeutic effect of sodium aescinate on allergic contact dermatitis （ACD） in mice.Methods Sixty SPF Kunming mice were randomly divided into six groups： normal control group， model control group， positive control group， low， medium and high dose group of sodium aescinate （SA） （1.8， 3.6 and 7.2mg/kg）， with 10 mice in each group. ACD model of mice was established by sensitization and stimulation with 2，4-dinitrochlorobenzene （DNCB）. Auricular swelling， spleen index and histopathological examination were used as evaluation indexes. Results Sodium aescinate can alleviate the inflammation of abdominal skin lesions， inhibit the increase of auricle swelling and reduce the spleen index of mice. With the increase of SA concentration， the edema and degeneration of dermal cells were alleviated， and the infiltration of inflammatory cells was reduced. Conclusions Sodium aescinate has a certain therapeutic effect on allergic contact dermatitis in mice， and its mechanism needs further study.

Keywords：Sodium Aescinate;Allergic Contact Dermatitis;Aesculus Chinensis

七葉樹(shù)又名婆羅樹(shù)、梭羅樹(shù)，屬落葉喬木，與懸鈴木、榆樹(shù)、椴樹(shù)并稱為世界四大優(yōu)美行道樹(shù)。在我國(guó)種類較多，分布范圍廣。其中中華七葉樹(shù)（Aesculus chinensis Bge）、浙江七葉樹(shù)（A.chinensis Bge.var.ChekiangensisFang）和天師栗（A.wilsonii Rehd）的干燥成熟種子稱“娑羅子”，是中國(guó)藥典收載的常用中藥。娑羅子的主要成分為皂苷類化合物，具有疏肝、理氣、和胃、止痛、殺蟲(chóng)之功效[1]，還具有抗炎、消腫脹、抗?jié)B、抗癌作用[2]，來(lái)臨床用于治療冠心病。七葉皂苷鈉主要成分為七葉皂苷鈉A、B、C、D，是從七葉樹(shù)科植物天師栗的干燥種子娑羅子中提取得到的一種含酯鍵的三萜皂苷，其具有抗炎、抗?jié)B出，提高靜脈張力，加快靜脈血流，促進(jìn)淋巴回流，改善血液循環(huán)和微循環(huán)的作用[3]。臨床上用于腦水腫、創(chuàng)傷或手術(shù)所致腫脹，也用于靜脈回流障礙性疾病[4-5]。目前，已開(kāi)發(fā)出七葉皂苷鈉凍干粉針劑、七葉皂苷鈉搽劑、復(fù)方七葉皂苷鈉凝膠、七葉皂苷鈉片等劑型[6]。

變應(yīng)性接觸性皮炎（Allergic contact dermatitis，ACD） 是T細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)皮膚接觸致敏原的免疫反應(yīng)[7]，是最常見(jiàn)的皮膚病之一，具有難預(yù)防、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣的特點(diǎn)。減少炎性細(xì)胞聚集、促進(jìn)皮膚屏障功能恢復(fù)是目前治療ACD的一個(gè)突破口。小鼠耳廓ACD 模型是最常用的小鼠ACD 模型，已有數(shù)十年歷史[8]。該模型用耳廓作為皮炎的靶部位，根據(jù)炎癥耳廓的厚度及單位面積炎細(xì)胞數(shù)來(lái)判斷抗皮炎藥物的療效。DNCB丙酮液是一種常見(jiàn)的致敏劑，可致敏和激發(fā)動(dòng)物皮膚出現(xiàn)典型的接觸性皮炎損害，在制作變應(yīng)性接觸性皮炎動(dòng)物模型中被廣泛應(yīng)用[9-10]。該模型具有在二次抗原激發(fā)時(shí)不需要剔除毛發(fā)，炎細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)。研究表明七葉皂苷鈉對(duì)抗炎具有一定作用，但是其對(duì)ACD是否有抑制作用少有報(bào)道，本研究通過(guò)建立2，4-二硝基氯苯（ DNCB） 誘發(fā)的小鼠ACD模型，研究七葉皂苷鈉對(duì)小鼠ACD的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠，體重18～22g，60只，雌雄各半，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（鄂）2016 -0089，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：NO.42816300002333，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用證明編號(hào)：NO.00263059。每籠5只，只有進(jìn)食和飲水，飼養(yǎng)于本單位SPF級(jí)小鼠實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室溫度20～25℃，濕度40%～70%。

1.2 試劑和儀器 2，4-二硝基氯苯（DNCB）、丙酮（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純），復(fù)方醋酸地塞米松乳膏（批號(hào)：1802010S，華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司），七葉皂苷鈉（批號(hào)：170410A，武漢愛(ài)民制藥有限公司），電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司），倒置生物顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠ACD模型的建立 按

參考文獻(xiàn)建立模型[11-15]，小鼠腹部脫毛（3cm× 3cm）后，用5% DNCB 丙酮橄欖油（丙酮/橄欖油=4∶ 1）溶液100μL致敏，第2天再次涂100μL強(qiáng)化致敏。第5天小鼠右耳內(nèi)外側(cè)耳面涂以1%DNCB丙酮橄欖油溶液20μL進(jìn)行激發(fā)。

1.3.2 分組和給藥 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組，分別為：正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和七葉皂苷鈉組（分為低、中、高給藥組，其濃度分別為1.8、3.6和7.2mg/kg），每組10只，雌雄各半。正常對(duì)照組給予等量生理鹽水，按人與小鼠劑量換算公式，小鼠復(fù)方醋酸地塞米松乳膏用量為10mg/kg。所有藥物均于致敏前1d 將受試物均勻涂于各小鼠右耳的正反兩面，每日1次，連續(xù)給藥7d。除空白對(duì)照組，其它各組于給藥第2、3天進(jìn)行致敏和強(qiáng)化致敏，給藥第6天各組進(jìn)行激發(fā)。

1.3.3 小鼠ACD模型評(píng)價(jià)指標(biāo) 激發(fā)前、激發(fā)后48h分別對(duì)小鼠耳部紅斑、水腫、抓痕進(jìn)行評(píng)分作為耳部皮損情況評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1;耳部皮損情況評(píng)分為建模成功與否及過(guò)敏反應(yīng)程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.3.4 小鼠耳廓腫脹度和脾指數(shù)測(cè)定 激發(fā)后48h安樂(lè)死處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，用7mm 打孔器分別在兩耳同一部位打下耳片，稱重，以兩耳片的重量差異為腫脹度。耳廓腫脹抑制率計(jì)算如下：抑制率（%） = （模型對(duì)照組腫脹度-實(shí)驗(yàn)組腫脹度） /模型對(duì)照組腫脹度 × 100%。同時(shí)取小鼠脾臟稱重，以每10g體重的脾質(zhì)量作為脾指數(shù)。

1.3.5 小鼠耳廓組織病理學(xué)檢查 激發(fā)后48h，每組分別取5只小鼠，取右耳皮膚組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋固定，制成5μm薄層切片，以蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）進(jìn)行染色，并使用光學(xué)顯微鏡觀察皮膚組織的病理變化，主要包括真皮水腫程度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及其數(shù)目變化等情況。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 19. 0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。計(jì)量資料滿足正態(tài)分布時(shí)，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）法，滿足方差齊性時(shí)兩兩比較用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnetts T3 法依次檢驗(yàn)第i組實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間的差別;實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布時(shí)，多組比較采用 Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用秩和檢驗(yàn)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠ACD模型評(píng)價(jià)指標(biāo) 小鼠經(jīng)耳部給予1% DNCB，激發(fā)30min后，可見(jiàn)耳部激發(fā)處皮膚開(kāi)始紅腫，小鼠搔抓現(xiàn)象明顯;48h后模型組小鼠耳部紅腫明顯，陽(yáng)性對(duì)照組和不同劑量給藥組耳部紅腫出現(xiàn)不同程度的緩解，陽(yáng)性對(duì)照組基本恢復(fù)正常，不同劑量給藥組耳部紅腫呈現(xiàn)劑量依賴性趨勢(shì)，表明小鼠 ACD 模型成功建立。小鼠耳部皮膚狀況，評(píng)價(jià)指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 各組藥物對(duì)ACD模型小鼠耳腫脹度的影響 七葉皂苷鈉給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組均能對(duì)DNCB所致的小鼠耳廓腫脹有明顯抑制作用，其中高、中劑量組均可明顯抑制DNCB誘發(fā)的小鼠耳廓腫脹，與模型組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），并且高劑量組的腫脹抑制率（76.05%）與模型組（79.10%）接近，各劑量組的效果呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系趨勢(shì)。見(jiàn)表3。

2.4 小鼠ACD模型耳廓皮膚組織病理變化 空白對(duì)照組耳組織整體結(jié)構(gòu)輕度異常，表皮細(xì)胞排列整齊（粗實(shí)線箭頭），真皮層細(xì)胞無(wú)明顯水腫變性，組織無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組耳組織整體結(jié)構(gòu)異常，可見(jiàn)部分表皮細(xì)胞壞死變性（粗實(shí)線箭頭）;真皮層膠原纖維排列紊亂，真皮層細(xì)胞可見(jiàn)廣泛水腫部分胞漿空泡化（細(xì)實(shí)線箭頭）;且組織可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（細(xì)虛線箭頭）。七葉皂苷鈉低劑量組耳組織整體結(jié)構(gòu)基本正常，真皮層細(xì)胞可見(jiàn)輕微水腫（細(xì)實(shí)線箭頭），組織無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。中劑量組耳組織整體結(jié)構(gòu)基本正常，真皮層細(xì)胞減少，無(wú)明顯水腫變性，組織可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（細(xì)實(shí)線箭頭）。高劑量組的耳組織整體結(jié)構(gòu)基本正常，真皮層細(xì)胞無(wú)明顯水腫變性，組織無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。七葉皂苷鈉3個(gè)劑量組表皮細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)輕度水腫，以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)都有一定程度的減少。表明七葉皂苷鈉對(duì)DNCB誘導(dǎo)的ACD模型有明顯的抑制作用。結(jié)果如圖1所示。

2.3 各組藥物對(duì)ACD模型小鼠脾指數(shù)影響 陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的脾指數(shù)低于正常對(duì)照組，而七葉皂苷鈉各劑量組小鼠脾指數(shù)均高于空白對(duì)照組，顯著低于模型組（P<0.05）。復(fù)方醋酸地塞米松乳膏為糖皮質(zhì)激素類藥物，有免疫抑制作用，用藥后小鼠脾指數(shù)降低。七葉皂苷鈉各組可能通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫、促進(jìn)免疫器官發(fā)育、恢復(fù)異常體液免疫功能，使免疫系統(tǒng)趨于平衡來(lái)發(fā)揮作用，使得小鼠脾指數(shù)降低。結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

ACD是最常見(jiàn)的皮膚病之一，具有難預(yù)防、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣的特點(diǎn)，治療的常用藥中，抗組胺藥對(duì)炎癥介質(zhì)組胺有拮抗作用，對(duì)I型超敏反應(yīng)有效，但不能抑制IV型超敏反應(yīng)病變部位的炎細(xì)胞浸潤(rùn);糖皮質(zhì)激素類雖然顯效快、作用強(qiáng)、療效確切，但長(zhǎng)期應(yīng)用可誘發(fā)腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)或減退，存在反跳現(xiàn)象和停藥綜合癥，因而不適合長(zhǎng)期臨床應(yīng)用[11]。小鼠耳廓ACD 模型用耳廓作為皮炎的靶部位，根據(jù)炎癥耳廓的厚度及單位面積炎細(xì)胞數(shù)來(lái)判斷抗皮炎藥物的療效。孫明立等[16]建立豚鼠和小鼠ACD模型，驗(yàn)證了DNCB誘導(dǎo)ACD模型的可行性，且小鼠相較于豚鼠具有模型制作時(shí)間更短，對(duì)致敏物敏感性較強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。研究對(duì)七葉皂苷鈉治療ACD藥效進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明七葉皂苷鈉在治療ACD方面療效明顯，且無(wú)糖皮質(zhì)激素類藥物類副作用，提示七葉皂苷鈉在治療ACD中具有一定的優(yōu)勢(shì)，其相關(guān)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2019-10-23 編輯：程鵬飛）