內源性神經干細胞治療多發性硬化的研究進展

周 舒，陳武龍，徐君銘，王淑芬

（昆明醫科大學分子臨床醫學研究院暨云南省干細胞和再生醫學重點實驗室，云南昆明 650500）

多發性硬化癥（multiple sclerosis，MS）是以中樞神經系統炎性脫髓鞘為主要病理特征的自身免疫性疾病，是世界范圍內青壯年常見的非創傷性、致殘性神經系統疾病[1]。在全球范圍內有超過250萬患者，且女性罹患MS 風險遠高于同齡男性[2]。目前尚不清楚多發性硬化的發病誘因，流行病學調查表明，MS 是由遺傳、環境等因素相互作用的結果，是具有多因素起源的由免疫介導的異質性疾病[3]?；谌蚪M關聯研究，230 余種遺傳變異與MS風險增加相關，且大多數變異都為免疫相關基因，高緯度、維生素D 缺乏、EB 病毒感染、抽煙均可增加MS 的易感性[4]。長久以來，MS 的治療一直面臨巨大的挑戰，目前臨床上沒有靶點藥物和針對性的治療方法，應用于MS 的治療藥物最佳應用窗口期非常短暫，且通常價格高昂，最重要的是這些藥物均無法從根本上阻止疾病進展也不能逆轉患者軀體運動和感覺功能障礙[1]。

1 多發性硬化癥的髓鞘再生和神經保護治療

MS 病理生理學機制目前尚未完全明確，慢性和反復發作的炎性反應可能干擾神經細胞和軸索環境的穩態，通過影響離子通道活性、引起線粒體損傷和氧化應激損傷等機制，引起患者CNS 灰質及白質內髓鞘脫失的廣泛發生[5-6]。髓鞘是中樞神經系統中由少突膠質細胞包繞神經元軸突形成的多層脂膜結構，為軸突提供營養和代謝支持，是神經電信號得以高速準確傳導的基礎并與神經可塑性息息相關。髓鞘的脫失使得軸突非常脆弱，如果軸突不能及時被髓鞘重新包裹，可發生變性壞死[7]。中樞神經系統脫髓鞘性疾病發生后，機體通常迅速啟動內源性修復機制，MS 患者腦組織尸檢病理結果證明髓鞘再生現象是普遍存在的，在MS 急性期與慢性期病灶中均可發生[8]。由進一步的研究表明，病灶中髓鞘再生的比例隨著疾病的進展而降低，慢性病灶的髓鞘再生現象通常僅限于病灶周邊區域[9]。隨著病程的進展，機體自發性的髓鞘再生效率衰減、神經元軸突退變持續累積，是MS 患者進行性的、不可逆的神經功能障礙的根本原因[10]。而綜合分析MS 患者臨床表現、影像學特征和實驗室檢查結果發現，MS 患者自發性髓鞘再生的程度存在很大個體差異，髓鞘再生水平高的患者神經功能障礙程度較輕，表明MS 神經功能恢復很大程度依賴于內源性修復機制的動員[11]。而MS 中樞神經損傷修復的關鍵在于成體中樞神經系統少突膠質細胞的增殖分化及其介導髓鞘再生修復。迄今為止普遍認為髓鞘再生主要由少突膠質細胞前體細胞（oligodendroglial precursor cells，OPCs）介導，可能由于MS 慢性脫髓鞘區域內存在多種OPCs 分化相關抑制劑，病變部位檢出大量無法分化為成熟髓鞘化OLs 的OPCs[4]。此外，成體中樞神經系統內神經干細胞在促進髓鞘再生方面同樣蘊含巨大潛力。

2 內源性神經干細胞參與髓鞘再生修復

在過去數10 a 中，在成年中樞神經系統的特化區域發現了內源性的NSCs，其自我更新和多向分化的潛能貫穿終生[13]，對于神經系統的發育、神經組織穩態的維持和損傷的修復至關重要。MS 中樞神經系統髓鞘脫失造成的神經損傷可迅速啟動內源性修復機制，CNS 中活化的NSCs 可增殖、啟動分化程序遷移至損傷部位替換損傷的髓鞘化OLs。部分研究表明，病灶區檢測的衍生自NSCs的OLs 數量高于衍生自OPCs 的OLs 數量。并且NSCs 介導的新生髓鞘具有正常厚度，而OPCs 介導的髓鞘再生髓鞘較薄[14]。此外，NSCs 還可通過分泌神經營養因子及抑制神經再生阻礙因子等作用使髓鞘脫失的神經纖維以及新生的神經纖維包繞髓鞘，從而重構神經結構，促使患者運動、感覺功能得到不同程度的恢復[15]，這些研究成果為通過內源性神經干細胞途徑治療MS 提供基礎理論支持。

NSCs 在胚胎發育早期主要存在于神經管的神經上皮[16]。在成體哺乳動物中樞神經系統中，NSCs大多數位于側腦室的室管膜下區（subventricular zone，SVZ）和海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）的亞顆粒層區域（subgranular zone，SGZ）[16]。SVZ區是成體最大的NSCs 生發區，其中大多數NSCs處于靜止狀態，同時表達CD133（Prominin-1）和GFAP。這些靜止的NSCs 又被稱為靜息神經干細胞（quiescent NSCs，qNSCs）或B1q 型細胞，當其自身或環境的信號發生變化時，能夠響應這些變化而被激活產生表達表皮生長因子受體（EGFR）的增殖性活化型神經干細胞（activated NSCs，aNSC），又稱為B1a 型細胞（GFAP+CD133+EGFR+）。B1 型細胞和室管膜細胞（Ependymal E cells）交錯排列構成了風車樣結構的側腦室外側壁。被激活的NSCs 可依次產生神經祖細胞（Neural progenitor cells，NPCs 或Transit-amplifying cells，TACs 或C型細胞）。C 型細胞（GFAP-EGFR+）增殖旺盛，可分化為表達唾液酸-神經細胞黏附分子（PSA-NCAM）的A 型神經母細胞（Neuroblast A cells）。A 型細胞可沿一條高度局限的通道——吻側遷移流（rostral migratory stream，RMS）遷移至嗅球（olfactory bulb，OB），隨后分化為中間神經元并整合入神經回路。此外，SVZ 區NSCs 還可以增殖遷移至周圍區域（例如胼胝體、紋狀體）分化產生能形成髓鞘化OLs。成體海馬SGZ 區的NSCs 通常處于靜息或休眠狀態，通過不對稱分裂形成放射狀狀星形膠質細胞。放射狀星形膠質細胞能夠快速增殖、并從顆粒下層向顆粒層遷徙逐步成熟形成谷氨酸能海馬齒狀回顆粒神經元[18]。

多項研究證實，脫髓鞘改變誘使SVZ 區NSCs向OLs 方向分化的比例大幅增加，胼胝體、紋狀體及穹窿海馬傘均發現了由NSCs 介導的自發性的髓鞘再生現象[19]。而相同情況下，SGZ 區的NSCs似乎僅能分化形成神經元，在對其進行基因重編程或營養因子處理之后才可分化形成OLs[19]。在這種自發性的損傷修復過程中，內源性NSCs 增殖與分化的命運決定受到諸多因素制約，在缺乏任何外源性干預的情況下，髓鞘化OLs 生成效率較低、組織重建和修復非常緩慢甚至停滯、難以有效逆轉MS 患者的病情進展。通過藥物治療或其他手段干預，可以激活、募集內源性NSCs，并誘導其有效發揮神經修復作用，且與外源性細胞移植相比，可以避免免疫排斥、倫理糾紛和腫瘤形成的風險，是最接近于臨床應用的治療方法，故采用外源干預措施動員內源性NSCs 進行髓鞘修復再生，已成為延緩、預防或逆轉MS 進展最合適的前景之一[21]?，F就內源性NSCs 在中樞神經系統髓鞘修復再生的研究進展進行綜述，為潛在的醫療制藥方面提供了可供參考的思路。

3 細胞外信號調控神經干細胞髓鞘再生修復的分子機制及調控靶點

神經干細胞命運維持和重塑取決于多種細胞內在機制及其與微環境的動態相互作用[22]。神經干細胞微環境（Niche）是一個高度復雜的、能夠發生動態變化的NSCs 生活微生態系統，包括可溶性的信號分子、粘附信號分子、細胞間的相互作用、細胞與胞外基質之間的相互作用、構成微生態立體結構的機械力以及代謝產物、氧氣等理化因素。不同發育時期特定細胞群體的轉錄組測序分析表明，NSCs 與微環境細胞具有協同發育和共享基因表達的特點[23]，血管內皮細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞、室管膜細胞、神經干細胞及其子代細胞是神經微環境的主要細胞組分。

固有免疫及適應性免疫應答及相關的炎癥反應是MS 重要的病理基礎[1，23]，在MS 進行性的神經退變中也發揮重要作用。對于NSCs 介導的內源性損傷修復過程中，免疫細胞與NSCs 及其子代細胞的相互作用對后者的命運及功能整合起決定性作用[24]。MS 患者機體CNS 中慢性和反復發作的炎性反應可激活神經干細胞Niche 中的小膠質細胞和星形膠質細胞[25]，二者釋放的促炎因子及細胞毒性物質可募集輔助性T 細胞17（Thy17）等免疫細胞浸潤，既對Niche 的結構和功能造成巨大影響，又直接作用于NSCs、影響內源性的再生修復過程[26]。有研究表明腦內小膠質細胞和Th17 細胞的浸潤協同促進MS 腦內髓鞘損傷[27]。Th17 細胞和調節性T細胞（Treg）均由初始CD4+細胞分化而來，Th17細胞能夠分泌促炎癥因子IL-17，Treg 則是機體免疫耐受得以維持的重要保證，二者的平衡對于自身免疫性疾病的治療具有重要意義。加州大學的研究人員發現一種小分子化合物可以促使Th17 細胞分化為誘導型調節性T 細胞（iTreg），使用這種藥物促進了實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠的髓鞘再生[28]。最近研究發現，阿司匹林通過IL-11 促進Treg 穩定性并改善EAE 小鼠髓鞘再生，緩解了疾病的進展[29]。在MS 適應性和先天性免疫反應過程中，活化的星形膠質細胞可分泌炎性因子TNF-α、IL1β 和IL6[29]；神經生長因子（NGF）、腦源性神經營養因子（BDNF）、血管內皮生長因子（VEGF）和白血病抑制因子（LIF）表達上調[31]。LIF 可對TNF-α 誘導的少突膠質凋亡發揮保護作用，且這一保護作用呈劑量依賴性[32]。星形膠質細胞表達BMP 配體及其受體，BMP4 信號可以誘導NSCs 分化為星形膠質細胞。脫髓鞘過程中在腦室內注射BMP4 拮抗劑Noggin 后，髓鞘化OLs 數量以及髓鞘再生程度顯著上升[33]。在腦室注入另一種BMP 抑制劑Chordin，可使得原本向嗅球成神經細胞方向分化的NSCs，轉為分化生成OLs[34]。MS 患者活動性病灶和伴有組織壞死和膠質瘢痕病灶中的星形膠質細胞中EGFR 的表達均上調，表明EGF 信號傳導與星形膠質細胞增生和神經膠質瘢痕形成有關[35]。應用抗EGF 抗體治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）動物，可顯著促進其神經發生和OLs 的生成[36]。同樣的，成纖維細胞生長因子（FGF2）注射入側腦室后，不僅調動了NSCs 的增殖，而且可以誘導NSCs 分化為OLs[37]。

小膠質細胞作為CNS 固有免疫反應的主要介質，其在MS 損傷修復過程中具有雙重作用，一方面促進髓鞘再生修復，另一方面致使神經退變。小膠質細胞的吞噬過程是清除神經系統內凋亡細胞、髓鞘碎片等物質的主要途徑[38]。抗炎細胞因子如白細胞介素-4（IL-4）和白細胞介素-13（IL-13）可誘導小膠質細胞向M2 方向極化。M2表型小膠質細胞通過分泌轉化生長因子-β（TGF-β），IL-10 和精氨酸酶-1（Arg-1）等多種抗炎介質，促進損傷后髓鞘再生[39]。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARγ）是一類由配體激活的核轉錄因子，是核受體超家族中的成員之一。在神經再生過程中，M2 小膠質細胞分泌的IGF-1 和TGF-β1 通過PPARγ 介導的信號途徑推動NSCs向OLs 的分化，從而促進髓鞘再生[40]。而在MS 炎癥環境、或細菌脂多糖（LPS）、干擾素-γ（IFN-γ）等促炎因子誘導下，小膠質細胞可以迅速激活并伴隨表型極化。在MS 活躍期，小膠質細胞極化為M1 型，細胞分泌因子發生顯著變化，一氧化氮合酶（iNOS）表達顯著上升，胞內活性氧簇（ROS）積聚，還可分泌白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和補體C1q（Complement 1 subunit q，C1q）等促炎因子以及多種趨化因子。MS患者機體髓鞘脫失與軸突損傷涉及氧化應激和神經免疫炎癥反應機制[24]。iNOS 經炎癥介質刺激可催化生成大量一氧化氮（NO）。體內體外實驗均顯示，SVZ 區NSCs 暴露于一氧化氮（NO）中會使其神經元限制性沉默因子（NRSF/REST）表達水平上調，從而誘導NSCs 分化生成為OLs，但抑制了神經元的生成[41]。Nrf2 是調控細胞氧化應激反應的重要轉錄因子，同時也可以調節促炎因子，在神經炎性反應中發揮神經保護作用。有研究表明，ROS介導的氧化應激增加可誘導衍生自NSCs 的OLs 生成，而這與Nrf2 表達上調有關[42]。以Nrf2 為靶點的MS 治療藥物富馬酸二甲酯于2013 年被FDA 批準為治療復發型多發性硬化患者的一線藥物。MS早期鞘內注射美滿霉素可通過抑制M1 型小膠質細胞的活化，來增加NSCs 的增殖及其在SVZ 區分化成熟為髓鞘化OLs 的能力。

血管內皮細胞通過分泌血管內皮細胞生長因子（VEGF）、鞘氨醇-1-磷酸（S1P）、β-細胞素（BTC）等細胞因子以及一些細胞外基質成分，對NSCs 增殖分化以及命運決定調控發揮重要作用[42-43]。MS 患者室管膜細胞和脈絡叢上皮細胞可分泌腦脊髓液中眾多重要的信號因子，例如TGFs，IGFs，PDGFs，SHH（sonic hedgehog，SHH），WNTs（Wingless/integrated）和BMPs 等，均可作用于神經干細胞的增殖和分化[44]。在體外培養成體NSCs 時，在培養基內加入睫狀神經營養因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）后，分化為OLs 的NSCs 比例大量增加。CNTF 屬于IL-6 家族的神經營養分子，在MS 動物模型中的研究表明，CNTF可以通過激活JAK-STAT 信號通路誘導在脫髓鞘病灶區NSCs 的髓鞘再生修復，并且對成熟的OLs 發揮神經保護作用[45]。

隨著MS 患者年齡的增長，外在微環境的改變相對內在因素對NSCs 命運決定過程具有更加重要的調控作用，主要包括循環代謝物改變和炎癥的增加[46]。機體的衰老致使CNS 發生炎癥浸潤[22]，NSCs周圍微環境（Niche）來源的炎癥信號促使NSCs 轉入靜息態，通過抑制WNT 信號通路拮抗劑sFRP5的活性可促進NSCs 的活化增殖，增加神經元及OLs 的分化[47]。Richard Reynolds 等[48]研究顯示，即使80 歲MS 患者SVZ 區的NSCs 分化生成OLs 的能力仍然完好無損。這項研究表明，MS 患者反復發作的炎癥反應不一定會限制其內源性NSCs 分化形成OLs 的能力。

通過單細胞轉錄組測序技術對SVZ 區NSCs 的轉錄組進行分析，揭示了SVZ 區內NSCs 存在胚胎起源、譜系分化和空間的異質性[49-50]。腹側SVZ 區NSCs 通常分化產生嗅球區的成神經細胞，背側SVZ 區NSCs 則具有分化生成少突膠質譜系細胞的潛力[51]。且背側SVZ 區NSCs 在脫髓鞘動物模型中相較于腹側區顯示出更強的增殖、分化與髓鞘再生修復能力。現已證明WNT/β-catenin 信號轉導通路對于調控成體背側SVZ 區NSCs 的譜系分化發揮主要作用[52]。糖原合酶激酶3β（GSK3β）可以通過磷酸化β-catenin 起到對WNT 信號通路抑制的作用。腦室內注射GSK3β 特異性抑制劑可促進化學誘導的脫髓鞘后髓鞘再生[53]。

4 細胞內信號調控神經干細胞髓鞘再生修復的分子機制及調控靶點

神經干細胞微環境內的信號轉導觸發信號級聯反應，從而激活細胞內調節機制，包括轉錄因子、表觀遺傳修飾和代謝等。靜息態NSCs 的活化是中樞神經系統穩態維持和神經再生的重要過程，涉及表觀調控、轉錄激活、RNA 加工、蛋白質合成、DNA 復制、線粒體生成以及代謝途徑的轉變等。伴隨年齡增長，NSCs 往往可出現多種內在機制的變化，衰老NSCs 可發生端粒耗損、線粒體功能損傷、蛋白質穩態失衡及溶酶體自噬功能等一系列細胞內代謝調控的改變，致使其靜息態的維持與退出過程發生紊亂，表現為NSCs 的增殖和自我更新水平顯著下降，神經元生成大幅減少[54]。然而，NSCs的少突膠質生成基本上不受衰老的影響[55]，但仍無法彌補MS 患者髓鞘再生的不足。通過重新激活老年小鼠SVZ 區NSCs 端粒酶活性，或者激活衰老靜息態NSCs 內溶酶體，均可顯著增加神經生成和髓鞘化OLs 的生成[56，16]。

調節轉錄表達網絡對于NSCs 多能性和自我更新的維持舉足輕重。WNT/β-catenin 信號通路可以調控細胞周期，在神經系統發育的過程中起關鍵作用，它參與了神經干細胞的增殖、分化、空間分布的調節等重要過程。p57kip2 是一種細胞周期抑制因子，可抑制NSCs 的增殖。抑制NSCs 中p57kip2 的表達后，NSCs 可迅速大量擴增，且OLs生成比例大幅提高。此外，將抑制p57kip2 表達的SGZ 區NSCs 移植入成體脊髓中后大部分可分化為OLs[57]。SVZ 背側可檢測到WNT 信號通路下游信號靶標Prox1，該轉錄因子可驅動背側SVZ 區NSCs向OLs 分化[58]。而Prox1 蛋白在成體海馬DG 區扮演著不同的角色，是確保齒狀回正常發育以及成體NSCs 分化為顆粒細胞的關鍵因子[59]，故可抑制DG區NSCs 向OLs 的分化，這表明神經干細胞的增殖分化等行為高度依賴于其生長的微環境。Gli1 蛋白為SHH 信號通路末端的轉錄因子，研究者表明它以獨立于SHH 的抑制作用決定了NSCs 的命運選擇[60]。用藥理學手段或者基因干預手段抑制Gli1 表達，顯著地促進了NSCs 的增殖、OLs 的分化及成髓鞘作用[60]。與Gli1 相似，Sirt1（NAD+依賴的去乙酰化酶Sirtuins 家族成員）的失活增強了NSCs向OLs 的分化和生成[61]。在NSCs 特異性Sirt1 失活的MS 動物模型中，Sirt1 的失活提高了髓鞘損傷時的髓鞘再生速率，并改善了MS 小鼠模型的臨床表現。同樣的，Pbx1 蛋白是神經發生的正調控因子，它可以促進成體SVZ 區NSCs 向神經元的分化，但它的缺失則誘使NSCs 向OLs 分化[62]。對神經祖細胞的基因表達譜分析表明，核因子Ⅰ（the nuclear factorⅠ，NFⅠ）家族基因在神經膠質祖細胞中特別表達。核因子ⅠX（nuclear factor 1 X-type，NFⅠX）是NFⅠ轉錄因子家族的成員之一，是一種調節NSCs 活性同時也是調節NSCs 分化的重要因子體內體外實驗證實，NFⅠX 存在時SVZ 區NSCs 向OLs 分化的能力下降。而NFⅠ家族另一種轉錄因子NFⅠB（nuclear factor 1 B-type）則是成體海馬DG 區NSCs 分化為OLs 所必需的轉錄因子，不過Drosha 的存在使得NFⅠB 的mRNA 發生降解，所以阻斷了成體海馬DG 區NSCs 向OLs 方向的發育[19]。轉錄因子Ascl1 在神經發育中起關鍵作用，是轉錄因子家族bHLH 中重要成員之一。通常SGZ區干細胞僅分化為神經元，利用慢病毒使Ascl1 在SGZ 區NSCs 中特異性的過表達，可誘導SGZ 區NSCs 分化產生OLs[63]，并且使得由白喉毒素（diphtheria toxin，DT）誘導的海馬區脫髓鞘重新髓鞘化[64]。而另外一個bHLH 轉錄因子家族中重要成員少突膠質細胞系轉錄因子2（Olig2）在SGZ 區NSCs 的過表達也可誘導其分化為髓鞘化OLs[65]。Zfp488 是少突膠質細胞特異的鋅指轉錄因子，其表達模式與髓鞘基因類似，體內體外實驗顯示，表達Zfp488 的NSCs 可以分化形成髓鞘化OLs[66]。

5 總結與展望

雖然目前對于多發性硬化的治療沒有根本性的治療方法，但免疫調節藥物的應用可以有效降低復發率、延緩疾病的惡性進展。神經干細胞的發現，改變了以往認為成年哺乳動物中樞神經系統的神經細胞不能再生的觀念。NSCs 廣泛分布于中樞神經系統中，在病理狀態下具有神經譜系多向分化潛能，已成為MS 神經損傷修復和再生研究的熱點。臨床上通過細胞移植來治療MS 存在諸多因素的限制，而采用外源干預措施促進MS 患者腦內固有神經干細胞增殖是一種較為穩妥和安全的方法。NSCs 介導的髓鞘再生修復是由內在細胞信號和外在微環境調節的復雜生物過程，本文總結了內源性NSCs 維持自我更新和決定譜系分化中的關鍵調控因子（圖1），這些結果為基于內源性NSCs 的MS 治療策略提供了許多有希望的潛在治療靶點，需要更加系統深入探索驗證以將潛在靶點轉化為藥理學備選。

圖1 中樞神經系統中神經干細胞分化和髓鞘再生修復過程的分子調控機制Fig.1 The molecular regulation mechanisms of the differentiation and remyelination of neural stem cells in CNS