定量遺傳毒性風險評估研究進展

霍 嬌，朱雪嬌，曾 珠，劉運杰，陳錦瑤*，張立實*

(四川大學華西公共衛生學院，四川省食品安全監測與風險評估重點實驗室，四川 成都 610041)

早在20世紀70～80年代，北美、日本和歐洲就開始使用標準遺傳毒性試驗組合來評價外源化學物的遺傳毒性從而對其進行管理[1-2]。標準遺傳毒性試驗通常包括一項體外基因突變試驗、一項體外染色體損傷試驗和一項體內染色體損傷試驗。管理毒理學通常根據標準試驗組合的結果，將物質分為兩種，即“具有遺傳毒性”和“不具有遺傳毒性”，并且這一評價模式也持續應用至今[3-5]。此種定性評價物質遺傳毒性的理論基礎主要為“一次打擊”(one-hit)模型，也就是只要存在一個具有遺傳毒性的外源化學物分子與DNA 發生交互作用，即可導致DNA損傷，從而引起突變，乃至腫瘤的發生?；凇耙淮未驌簟蹦Ｐ屠碚?，化學物的遺傳毒性劑量-反應關系是一條直線，不存在類似于一般毒性劑量-反應關系曲線中的“閾值”。

近年來，隨著高通量試驗技術的發展，越來越多的研究表明化學物在低劑量下的劑量-反應關系也應為曲線。最初發現并確認這一劑量-反應關系的一類物質是非整倍體誘導劑(如秋水仙素)[6]，而后研究發現誘導基因突變的物質(如甲基磺酸乙酯、甲基磺酸甲酯和N-乙基-N亞硝基脲等)也具有類似的低劑量曲線效應[7-9]。關于遺傳毒性非直線劑效關系的證實促進了一系列實驗技術和研究理論的迅速發展，并為遺傳毒性定量評估提供了理論和實踐基礎。遺傳毒性低劑量的非直線效應提示遺傳毒性物質也可能存在一個不導致遺傳毒性產生的閾值，并可將其視為一個更為實際的指導值(與致癌性不一樣的保護性指標)，用于物質的安全性評價和風險評估工作。

2013 年，國際遺傳毒性試驗工作組(International Workshop on Genotoxicity Testing，IWGT)和國際生命科學學會健康與環境科學研究所(Health and Environmental Science Institute of the International Life Science Institute，ILSI-HESI)均成立了專門的工作組對定量遺傳毒性風險評估的系列問題進行了討論，并擬定將持續關注這一問題[10-11]。2007 年羅氏公司藥品奈非那韋(viracept)的甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)污染事件，也成功將定量遺傳毒性風險評估方法應用于人體實際暴露后的遺傳毒性風險評估[12-13]。本文將針對定量遺傳毒性的分子理論基礎、定量評估方法、其在管理毒理學中的意義等內容進行介紹和總結。

1 定量遺傳毒性風險評估對試驗方案/方法的要求

定量遺傳毒性風險評估的關鍵在于確定外源化學物的劑量-反應關系曲線，從而獲得可作為起始點(point of departure，PoD)使用的遺傳毒性閾值。PoD 是風險評估特征描述中的一個重要數值，作為外推參考劑量或是安全范圍的參考點[10]。獲得可靠PoD 數值需要較傳統遺傳毒性試驗更高通量、高涵蓋面、高準確度的試驗，例如使用流式細胞術和自動圖像分析系統等試驗方法，也正是由于這些試驗技術的發展才促使了定量遺傳毒性風險評估的發展[14]。

1.1 高通量

在檢測低劑量效應時，需要更高的統計學效能來區別更微小的差異，因此需要計數比傳統方法高百倍、甚至幾萬倍單位數量的細胞或分子。若使用傳統分析方法要耗費極大的人力和物力，此時若使用分析量更高效的方法，如流式細胞術、液相色譜-質譜聯用等技術即可達到理想的統計學效能[14-15]。

1.2 高涵蓋面

外源化學物的低劑量非直線效應通常在體內試驗中觀測，且由于遺傳毒性終點較多，涉及有害終點的關鍵分子事件也較多，因此需要更多動物進行實驗。在基于“3R”的原則上，為減少實驗動物的使用，需要一個內容涵蓋度更廣，即可檢測更多遺傳學終點、具有較強整合性的試驗方案。具有高兼容能力的遺傳毒性試驗方法，如外周血微核計數、Pig-a 基因突變試驗等是滿足這一條件的理想試驗方法。

1.3 高準確度

試驗在低劑量時具有較高的準確度和精密度是高檢驗效能的保證。使用客觀的分析方法，如使用圖像分析軟件，可提高試驗的準確度和精密度。

2 劑量-反應關系的定量分析方法

定量遺傳評估的最終目的是確定適宜用于外推至人類健康風險評估的PoD，對于可作為PoD 使用的遺傳毒性閾值仍處于討論中[15]。目前，3 個認可度較高的推導方案為：無可見遺傳毒性作用水平(no observed genotoxic effect level，NOGEL)、斷點劑量(breakpoint dose，BPD)和基準劑量(benchmark dose，BMD)，這3 個方案所得閾值也是IWGT 所推薦的適宜作為PoD外推的遺傳毒性閾值[10]。

2.1 無可見遺傳毒性作用水平

NOGEL 來源于一般毒性試驗中無可見有害作用水平(no observed adverse effect level，NOAEL)的定義。NOGEL 在遺傳毒性中概念和計算方法類似與NOAEL，即與對照組相比不引起相應遺傳毒性終點具有統計學意義升高的最高劑量水平，低于該劑量可能存在不具有統計學意義的水平改變。NOAEL在管理毒理學中的應用十分廣泛，而NOGEL 的推導方法和應用也與NOAEL 類似，是將遺傳毒性視為一般毒性中的有害作用而制定?？墒褂肈unnett’s、Dunn’s、Dunnett’s T3檢驗來計算NOGEL[16]。在對數據進行差異性檢驗時，建議可同時進行趨勢性檢驗[17]。特別是在具有較多劑量組的時候，趨勢性檢驗可增加NOGEL的參考價值。

2.2 斷點劑量

根據遺傳毒性作用模式(modes of action，MoA)，某些外源化學物(如氧化物)在低劑量下的劑效關系可能為一個曲棍形態，也就是雙直線模型(圖1A)。BPD即是針對這一遺傳毒性作用特征，基于雙線性模型(bi-linear)所推算的遺傳毒性閾值。在這一模型當中，劑量-反應關系為兩條直線交匯，低劑量時的直線斜率為0，較高劑量時為具有一定斜率的另一條直線。Lutz 等[18]和Muggeo 等[19]最初對雙線性模型及其計算方法進行了詳細描述，且該模型已成功應用于藥品奈非那韋(viracept)的EMS污染事件中人類遺傳毒性風險評估[12]。在實際應用時，通常選用BPD 的95%可信區間下限(the lower bound of breakpoint dose，BPDL)作為PoD。

BPD 在應用于計算PoD 時具有一定的缺陷。BPD 將化學物的劑量-反應關系擬合為兩條簡單的直線，而Crump[20]的研究發現大多數假設的劑量-反應關系曲線類型均可與雙線性模型良好擬合，且由BPD 推算出的BPDL 常包括0 值，不能用作PoD的推算。此外BPD 在劑量擬合時較BMD 更依賴于劑量組的數量、劑量設計間距和統計學效力[21]，因此IWGT 建議應在充分考慮化學物MoA的基礎上使用BPD作為PoD，且若最終選擇該方法推算人類健康風險時應更為慎重[10]。目前BPD可通過R軟件中的drsmooth 軟件包計算，使用的模型為Segmented Hockey Stick Test。

2.3 基準劑量

BMD是基于特定軟件和模型推算出的，相對于背景發生的特定反應水平改變的劑量(圖1B)。BMD方法是將所有實驗數據納入模型進行擬合，由最適宜的模型推算出發生特定反應水平改變時的一系列劑量。試驗前確定的特定反應水平稱為基準反應水平(benchmark response，BMR)，由此計算出的具有統計學可信區間下限稱為基準劑量下限(the lower bound of benchmark dose，BMDL)[22]。根據數據類型的不同(分類或連續型變量)、預設BMR 的不同(例如可設為5%或10%)、以及可信區間的不同(例如可為90%或95%)，BMDL可包括一系列數值。因此在推算BMDL 時需要充分考慮數據類型、有害作用的生物學意義和研究目的等因素。BMD 在一般毒性評估中的應用已經較成熟[23-24]，而在近年來定量遺傳毒性風險評估中也開始使用這一方法計算PoD[25-26]。

圖1 EMS肝細胞彗星試驗BPD和BMD模型擬合圖

BMD 是一個較穩健的推算PoD 的方法，較NOAEL 和BPD而言，BMD受劑量設計間距的影響最小，且僅需要3個劑量組即可進行擬合。若BMDL 來源于擬合優度最好的模型時，BMDL 的數值較BPDL 和NOAEL 而言應是最保守的數值[10]。目前可用于計算BMD 的軟件為荷蘭國家公共衛生與環境研究所(the Dutch National Institute for Public Health and the Environment，RIVM)開發的PROAST[27]和美國環境保護局(U.S.Environmental Protection Agency， U.S. EPA) 開 發 的BMDS software[28]。

IWGT 和ILSI-HESI 推 薦 的PoD 采 納 順 序 為：BMDL＞NOGEL＞BPDL。由于BMD 模型充分考慮了所有數據和劑量組且較為保守，因此被推薦作為計算PoD 的首選方法[10]。用于推算PoD的3種方法的優劣總結于表1。

表1 NOGEL、BMD和BPD方法比較

3 定量遺傳毒性風險評估在管理毒理學中的意義

相對于以往的定性評估，定量遺傳毒性風險評估具有更顯著的實際意義。在傳統評價模式上，食品、藥品中若存在遺傳毒性污染物，主要風險管理策略為將暴露降至可能性的最低(reduce exposure to as low as reasonably achievable，ALARA)[29]。使用這一方法不僅大大加重了各方的負擔，也使管理者無法區分風險的大小。IWGT、ILSI-HESI采用加拿大衛生部對遺傳毒性的解釋，認為在管理毒理學上遺傳毒性更應視為一個“善意”(bona fide)的保護性終點，而非在傳統意義上來說類似于致癌性的有害結局終點[10，14，30]?；谠摾碚?，使用定量遺傳毒性風險評估方法確定物質的遺傳毒性劑量-反應關系曲線，可用于推算人類健康風險的暴露范圍(margin of exposure，MOE)。若將遺傳毒性視為一個具有保護性的終點，甚至可用于建立類似于一般毒性的暴露限值的遺傳毒性參考劑量[14，31]。MOE的計算和參考劑量的建立有利于風險管理者對遺傳毒性風險較高的物質進行優先評估和管理，也有助于公眾和管理者在風險交流時對于不同情況下人群遺傳毒性風險大小的理解。

另一方面，定量外推人類致癌性風險需要動物致癌性研究或流行病學研究數據[29]，而這兩類研究則需要耗費大量的時間和資源，且大部分物質的研究數據并不充分。此外，由于遺傳毒性物質在環境中廣泛存在，污染的發生常難以避免和預測。而當實際污染發生時，使用定性評價方法難以評估實際暴露后的風險大小，而所需定量體內致癌性數據通常難以獲得。由于基于物質遺傳毒性劑量-反應關系曲線所得的PoD 可用于人體健康風險的外推和MOE的計算，使用定量遺傳毒性風險評估可有效解決上述兩項問題。2007年羅氏公司發生藥物EMS污染事件則是定量遺傳毒性風險評估實際應用的成功事例。該年羅氏公司提供的艾滋病病毒蛋白酶抑制劑奈非那韋發生了EMS 污染，導致病人長達3個月暴露于低劑量的EMS。歐盟藥品管理局使用定量評估方法對此次事件的實際暴露進行了評估，得出了暴露劑量不會對人體產生危害的結論[32]。

需要注意的是，不論是從生物學意義上或是從統計學意義上，目前還沒有關于遺傳毒性背景水平升高的明確界定[10]。從生物學上來說，很難說明超過自發突變水平的微小改變對人類遺傳毒性風險和致癌性風險的影響；從統計學角度，幾乎所有的生物學數據在統計學上都存在一個可計算的閾值。因此關于遺傳毒性閾值的理解和應用還需要更進一步的研究和討論。然而，IWGT和ILSI-HESI仍認為遺傳毒性閾值的確立和定量遺傳毒性風險評估具有重要的實際意義[31，33]。定量遺傳毒性風險評估可通過獲得遺傳毒性劑量-反應關系曲線外推人類的健康風險，最終可為避免人類遺傳毒性和致癌性風險升高采取切實可行的保護措施。

4 小結和展望

定量遺傳毒性風險評估的理念近年來得到了迅速的發展，其得益于一系列高通量、高涵蓋面、高準確度的自動化試驗方法的建立，也反向促進了這些試驗方法的迅速發展。定量遺傳毒性風險評估是在實際暴露情況的基礎上對人類的采取的保護性措施，相對于傳統遺傳毒性評價和管理模式具有更強的現實意義和保護性。盡管目前國際上還未建立關于遺傳毒性劑量-反應關系的定量評估指南，也還沒有建立將定量遺傳風險毒性評估如何用于管理毒理學決策的指南，但定量遺傳毒性風險評估策略和其伴隨的新興試驗方法可能將會對外源化學物遺傳毒性的評估和管理帶來較大影響。