泡沫細(xì)胞ABCA1和microRNA-33基因表達(dá)機(jī)制的探討

劉燕銀，陳玉甜，陳立強(qiáng)

（1.廣州市南沙區(qū)東涌醫(yī)院，廣東 廣州 511453；2.肇慶醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，廣東 肇慶 526060）

動(dòng)脈粥樣硬化是一種由于炎癥反應(yīng)引起膽固醇在單核細(xì)胞內(nèi)聚積而形成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞粘附于動(dòng)脈內(nèi)壁而形成動(dòng)脈斑塊及血管硬化的疾病，現(xiàn)在對(duì)膽固醇的在單核巨噬細(xì)胞內(nèi)積累還待深入研究[1]。泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出需要特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與有研究顯示ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體在膽固醇流出過程中發(fā)揮著重要作用，但是具體機(jī)制仍不清楚；近年研究亦發(fā)現(xiàn)microRNA在不同的疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，包括冠心病。microRNAs是21-23 nt組成的非編碼RNAs，其與mRNA3’-未翻譯結(jié)構(gòu)域序列互補(bǔ)結(jié)合并導(dǎo)致該mRNA的翻譯受抑制[2]。本研究通過觀察ABCA1和microRNA-33基因在THP-1細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與泡沫細(xì)胞中的表達(dá)變化，旨在初步探討ABCA1和microRNA-33基因在膽固醇流出的作用，為進(jìn)一步探討動(dòng)脈粥樣硬化形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 THP-1細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫，逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購(gòu)于大連寶生物公司，PCR引物由上海生物工程公司合成，miRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)于GeneCopoeia公司、Trizol購(gòu)于life公司、qRT-PCR自動(dòng)分析儀9700購(gòu)于ABI公司等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 THP-1細(xì)胞用含100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1懸浮細(xì)胞接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加160nmol/L佛波酯誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)24 h，使其分化成為巨噬細(xì)胞；培養(yǎng)24 h后更換含0.1%牛血清白蛋白的RPMI-1640培養(yǎng)基，同時(shí)加入50 μg/mL的乙酰化低密度脂蛋白，培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)其成為泡沫細(xì)胞。

1.3 方法

1.3.1 抽提THP-1細(xì)胞總RNA 取 TRIzol 處理好的勻漿THP-1細(xì)胞，室溫靜置；加入0.2 mL氯仿，劇烈震動(dòng)15 s，室溫靜置2 min；12000×g 4oC離心15 min，移上層水相至新EP管，加0.5 mL異丙醇，混勻后室溫靜置10 min；4oC 12000×g離心10 min 棄上清液，75%乙醇洗滌沉淀，4oC 7500×g離心5 min；棄上清空氣中干燥；20 μL無RNA酶水溶解總RNA，60oC孵育10 min。紫外分光光度儀檢測(cè)提取的總RNA 濃度，-80oC保存。

1.3.2 測(cè)定ABCA1基因RNA含量 根據(jù)ABCA1基因在文獻(xiàn)服務(wù)檢索系統(tǒng)（Pubmed）中查到的GenBank序列，按照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物，引物交由上海生物工程公司合成，ABCA1基因上游引物5’-CAGGAGGTGATGTTTCTGACCA-3’；下游引物5’-TTGGCTGTTCTCCATGAAGGTC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度449 bp；β-actin上游引物5’-GTGGGCCGCCCTAGGCACCAG-3’下游引物5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度538 bp。以提取的RNA為模板，反應(yīng)條件為50oC 30 min，94oC 2 min，94oC 30 s，58oC 30 s，68oC 40 s，35個(gè)循環(huán)。RT-PCR反應(yīng)完成后取3 μL RT-PCR產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠中于80 V恒壓電泳30 min，紫外透射儀觀察并拍照。圖片經(jīng)圖像分析軟件Band Scan進(jìn)行光密度值掃描分析，計(jì)算各泳道ABCA1與內(nèi)參照β-actin光密度之比作為ABCA1相對(duì)含量值。

1.3.3 熒光定量PCR 利用miRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄1 μg總RNA，按照GeneCopoeia公司說明書對(duì)microRNA特異性引物和接頭引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，用U6作為內(nèi)源性參照基因，檢測(cè)microRNA-33的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用Mean±SD表示，正態(tài)分布資料用單因素方差分析比較多組間差異，用t檢驗(yàn)比較兩組間的差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THP-1細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞中ABCA1基因mRNA表達(dá) 與對(duì)照組的THP-1細(xì)胞比較，巨噬細(xì)胞組ABCA1基因表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05），而泡沫細(xì)胞組ABCA1基因表達(dá)水平明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。THP-1細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞中ABCA1基因 mRNA表達(dá)分別為（0.329±0.025）、（0.336±0.023）和（0.537±0.046），見圖1。

2.2 microRNA-33檢測(cè)結(jié)果 如圖2所示，與對(duì)照組的THP-1細(xì)胞比較，巨噬細(xì)胞組microRNA-33基因表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05），而泡沫細(xì)胞組microRNA-33基因表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

ABCA1轉(zhuǎn)運(yùn)體通過利用ATP幫助底物進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，而在避免單核細(xì)胞泡沫化中ABCA1轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)揮著重要作用。膽固醇在單核細(xì)胞內(nèi)聚集使其泡沫化，泡沫細(xì)胞沉積于動(dòng)脈內(nèi)皮造成血管硬化、炎癥效應(yīng)和發(fā)展為動(dòng)脈粥樣硬化，研究表明microRNA-33與其作用基因（SREBF2和SREBF1）共同表達(dá)，協(xié)同表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子參與膽固醇和脂肪酸的合成與吸收[3]。因此，膽固醇流出并分解代謝是預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)很重要的因素，膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)需多種調(diào)節(jié)因子相互配合，包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族、清道夫受體家族、膽固醇調(diào)節(jié)蛋白和肝X受體等[4]。研究顯示對(duì)ABCA1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行基因敲除，可造成泡沫細(xì)胞膽固醇流出功能障礙而引起膽固醇積累和炎癥的發(fā)生，microRNA-33通過抑制SREBF2和SREBF1基因以及下游的細(xì)胞信號(hào)通路的表達(dá)，從而對(duì)參與膽固醇流出的基因進(jìn)行調(diào)控，包括ABCA1、ABCG1、NPC1和FAO（HADHB、CROT、CPT1A、PRKAA1）等基因[5-6]。

本研究通過利用人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系-1（THP-1）源性泡沫細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察細(xì)胞內(nèi)ABCA1和microRNA-33基因表達(dá)情況。課題組利用泡沫細(xì)胞模型，采用半定量RT-PCR檢測(cè)THP-1細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與泡沫細(xì)胞ABCA1和microRNA-33基因表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示與對(duì)照組的THP-1細(xì)胞比較，巨噬細(xì)胞組ABCA1基因表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05），而泡沫細(xì)胞組ABCA1和microRNA-33基因表達(dá)水平有明顯差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；因此膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)需ABCA1基因參與，ABCA1介導(dǎo)泡沫細(xì)胞膽固醇流出，而microRNA-33基因與ABCA1基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，本研究結(jié)果為動(dòng)脈粥樣硬化的形成提供了新的理論依據(jù)。