一次食源性致病菌質控樣的檢驗結果分析

譚建兵，周亮

（1.重慶市開州區婦幼保健院，重慶 405400；2.重慶市開縣疾病預防控制中心，重慶 405400）

1 實驗

1.1 材料 （1）考核樣品編號：CQ-ZK15，無菌管裝，每管裝3 g×2支。（2）培養基。腸道增菌肉湯、緩沖蛋白胨水（BPW）、GN增菌肉湯、EC肉湯、7.5%Nacl肉湯、李氏增菌肉湯、胰酪胨大豆多粘菌素肉湯、伊紅美藍（EMB）、山梨醇麥康凱（SorbitolMacConKey），血平板，李斯特氏菌科瑪嘉瓊脂、甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂、阪崎桿菌顯色培養基（DFI）、腸桿菌科細菌生化編碼鑒定系統E75/15，以上培養基均為北京陸橋試劑有限公司生產。API20E細菌生化編碼鑒定系統由法國梅里埃公司生產[1]。（3）診斷學清：致病性大腸埃希氏菌、侵襲性大腸埃希氏菌、產毒性大腸埃希氏菌診斷血清、出血性大腸埃希氏菌O157血清、沙門菌A-F多價O血清均為寧波天潤生物藥業有限公司生產，均在有效期內。

1.2 樣品處理 用40-50oC滅菌過的生理鹽水將奶粉充分溶解。

1.3 增茵培養 移取1 mL分別加入10 mL腸道增菌肉湯、緩沖蛋白胨水（BPW）、GN增菌肉湯、EC肉湯、7.5%Nacl肉湯、李氏增菌肉湯、胰酪胨大豆多粘菌素肉湯中，李氏增菌肉湯和胰酪胨大豆多粘菌素肉湯于30oC培養24 h，其余增菌液于36oC培養18-24 h。

1.4 分離培養 無菌操作取增菌液一環分別劃線接種相對的伊紅美藍（EMB）、木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽培養基（XLD）、山梨醇麥康凱，血平板，李斯特氏菌科瑪嘉瓊脂、甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂、阪崎桿菌顯色（DFI）平板各1塊。MYP瓊脂平板于30oC培養24 h，其余平板于36oC培養24 h。觀察所有培養基平板上的菌落形態、色澤等特點。發現李斯特氏菌科瑪嘉瓊脂平板、甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）平板、阪崎桿菌顯色（DFI）平板、山梨醇麥康凱平板、木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽（XLD）平板、伊紅美藍（EMB）平板上有可疑菌落，并將其涂片染色。

1.5 生化和血清學鑒定 （1）將李斯特氏菌科瑪嘉顯色培養基上的可疑菌落接種木糖、鼠李糖，36oC培養24 h，同時于TSA-YE平板上純化30oC培養48 h，挑取純培養的單個菌落接種SIM培養基30oC培養48 h并同時做生化鑒定，結果觀察如下：動力見傘狀生長，過氧化氫酶+，MR/VP+/-,溶血反應+，鼠李糖+，木糖-，甘露醇-，葡萄糖+，麥芽糖+，生化結果完全符合單增李斯特氏菌的生化特性。（2）將甘露醇卵黃多粘菌素培養基上的可疑菌落接種于營養瓊脂平板上純化，營養瓊脂平板上可見粗糙、毛玻璃狀的邊緣向外擴展菌落，挑取典型菌落做生化鑒定，結果如下：過氧化氫酶+、西蒙氏枸櫞酸鹽+、動力+、硝酸鹽+、VP+、木糖-、明膠+、甘露醇-、葡萄糖+，生化結果完全符合蠟樣芽胞桿菌的生化特性。（3）挑取山梨醇麥康凱培養基、木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽培養基、伊紅美藍培養基上的可疑菌落轉種于TSI上，36oC培養24 h后，三種培養基上的可疑菌落在TSI上生化表現相同，上層下層均變黃并產生大量氣體，挑取TSI斜面上的菌落進行純化培養后與致病性大腸埃希氏菌、侵襲性大腸埃希氏菌、產毒性大腸埃希氏菌多價O血清和出血性大腸埃希氏菌O157血清做玻片凝集試驗，結果都未發生凝集，生理鹽水對照不凝集。將木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽培養基上的可疑菌落進行純培養后與沙門氏菌多價O血清做玻片凝集試驗，結果為強凝集，生理鹽水對照不凝集。在進行血清凝集試驗的同時用北京陸橋有限責任公司生產的E75/15腸桿菌科細菌鑒定系統鑒定三種培養基上可疑菌落的純化菌落，生化鑒定結果均相同，鑒定編碼均為54265，查檢索表結果為：阪崎腸桿菌概率為97.36%，見表1。

取分純后的菌落同時采用API20E細菌生化編碼鑒定系統做生化鑒定，鑒定編碼均為3305373，查檢索結果為阪崎腸桿菌概率為98.40%，見表2。

2 結果

根據菌落特征、菌體形態、生化反應結果和血清凝集試驗，最終判定李斯特氏菌科瑪嘉顯色培養基上的可疑菌落為單增李斯特氏菌。甘露醇卵黃多粘菌素培養基上的可疑菌落為蠟樣芽胞桿菌。中山梨醇麥康凱培養基、木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽培養基、伊紅美藍培養基上的可疑菌落和阪崎桿菌顯色培養基上的可疑菌落為同一菌落，都是阪崎腸桿菌[2]。

表1 E75/15腸桿菌科細菌生化鑒定

表2 API20E細菌生化編碼鑒定系統

3 討論

本次考核樣檢測出了單增李斯特氏菌、蠟樣芽胞桿菌、阪崎腸桿菌共三株。通過這次食源性致病菌考核樣的檢測，總結出食源性致病菌鑒定經驗，也提高了實驗室的檢測能力和水平。在此次考核檢驗過程中也發現了一些問題：（1）分離培養時盡量采用多種增菌液和選擇性平板進行增菌培養和分離，比如這次檢出的阪崎桿菌在多種培養基如營養瓊脂、伊紅美藍、山梨醇麥康凱、木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽（XLD）上均能良好生長，在阪崎桿菌顯色培養基和TSA培養基上呈典型生長。在檢驗過程中，應該盡量多地挑選可疑菌落進行生化鑒定，以防漏檢。（2）做生化鑒定時，要將可疑菌進行分離純化，不然會影響最后結果判定。（3）在做血清凝集實驗時，選擇的菌落應用純培養菌落。在這次血凝實驗中出現了木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽（XLD）上生長的可疑菌落與沙門氏多價O抗原發生交叉凝集，最后該菌落經生化反應鑒定證實為阪崎桿菌，在實際工作中常出現生化結果與血清凝集實驗結果不符的情況，經過查閱文獻資料見[3]，發現阪崎桿菌與多種菌有交叉凝集的現象，比如沙門氏菌F群血清等，所以不能單憑凝集反應而做出結論，還應結合生化判定。（4）隨著致人類感染的致病微生物種、屬的不斷增加，以傳統生化試驗來鑒定微生物已不能適應鑒定的需要，而成套鑒定系統及編碼鑒定方法如API20E細菌生化編碼鑒定系統在實際工作中可以使細菌鑒定更加準確、簡易、快速[4-6]。