線葉菊黃酮滴丸抗耐青霉素金黃色葡萄球菌感染及免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)研究＊

馬睿婷 ，蘭耀東 ，包思成 ，王來(lái)兵 ，喬俊纏 ＊＊，渠 弼 ＊＊

（1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 呼和浩特 010050；2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 呼和浩特 010110；3. 包鋼第三職工醫(yī)院 包頭 014010）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是臨床上最常見(jiàn)的產(chǎn)毒素和酶最多致病菌之一，在葡萄球菌中毒力最強(qiáng)，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA），具有多重耐藥性，居院內(nèi)感染首位。1991年，黃文玉等[1]就篩選了27 種中藥對(duì)MRSA 的作用，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)中藥對(duì)SA和MRSA有一定的抑制作用，但是作用強(qiáng)度不一致。中醫(yī)歷來(lái)以清熱解毒治療許多急性感染性疾病，因此篩選有效抗MRSA的中藥引起了國(guó)內(nèi)中醫(yī)藥工作者的關(guān)注。

線葉菊[Filifolium sibiricum (L.)Kitam.]是菊科線葉菊屬多年生草本植物，在臨床上可用于傳染病高熱、疔瘡癰腫、血瘀刺痛、月經(jīng)不調(diào)、臁瘡、心悸、失眠等癥[2-4]的治療，亦可用于治療慢性支氣管炎[5]、腎盂腎炎[6]和各種化膿性感染[7]。研究結(jié)果表明，線葉菊的抗菌有效成分主要是黃酮類(lèi)化合物[8]，其對(duì)耐青霉素金黃色葡萄球菌、福氏志賀菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌等均有明顯的抑制作用[9]。我們以線葉菊黃酮為原料，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和方法將其制成滴丸[10,11]。為了給線葉菊黃酮滴丸的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了抗MRSA 和抗SA 感染及免疫調(diào)節(jié)作用的初步研究，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，具有一定的創(chuàng)新性，得到的研究成果有望能為開(kāi)發(fā)新的抗MRSA、SA 的中藥新藥提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)以供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 藥品與試劑

線葉菊黃酮滴丸（由赤峰天奇制藥有限責(zé)任公司提供，批號(hào)：20170701）總黃酮含量約為15%，按照實(shí)驗(yàn)要求將其用0.5%羧甲基纖維素鈉配成所需要濃度的混懸液；阿莫西林膠囊（修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：160801）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉（上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司，批號(hào)：200120905）；營(yíng)養(yǎng)肉湯粉（北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)中國(guó)藥品生物制品鑒定所監(jiān)制，批號(hào)：150222）；羧甲基纖維素鈉（常州市海拓實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。批號(hào)：4014806）；胃膜素（江蘇普華克勝藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20151003）；吉姆薩—瑞特染色液（北京諾博萊德科技有限公司，批號(hào)：c0352）；PBS（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20150228）；甲醛（天津市科盟化工工貿(mào)有限公司，批號(hào)：20111125）；無(wú)鈣鎂無(wú)酚紅的D-Hank’s 液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20150525）；貞芪扶正顆粒（吉林敖東藥業(yè)集團(tuán)延吉股份有限公司，批號(hào)：J20170614）。

1.1.2 菌種

ATCC-25923 金黃色葡萄球菌（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；耐青霉素金黃色葡萄球菌，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供，密封保存。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)昆明小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量20±2 g，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蒙）2015-0001，動(dòng)物飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物房；喂養(yǎng)飼料為SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)用鼠顆粒飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司，批號(hào)：20170826）。

1.1.4 儀器

單人雙面凈化工作臺(tái)（SW-CJ-1F，蘇州凈化設(shè)備有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)型分析天平（AB135-S，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；移液槍?zhuān)‥pendorf，德國(guó)艾本德有限公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（PYX-DHS-35，上海醫(yī)療器械七廠）；型蒸汽消毒器（YXQG02，山東新華醫(yī)療科技有限公司）；麥?zhǔn)媳葷峁埽ㄖ袊?guó)藥品生物制品檢定所）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9070MBE，上海博訊公司）；離子純水機(jī)（DZG-303A，美國(guó)摩爾公司）；離心機(jī)（YDL5M，湘儀離心機(jī)廠）。

1.2 小鼠急性毒性試驗(yàn)

取120只禁食不禁水12 h的小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為6 組，每組20 只，即0.5%羧甲基纖維素鈉空白滴丸組、線葉菊黃酮滴丸1、2、3、4、5 組。線葉菊黃酮滴丸1 組按總藥量（即滴丸藥粉濃度）0.4 g·mL-（1最大濃度）、0.04 mL·g-1小鼠體重（最大體積），灌胃1 次，計(jì)算1 日內(nèi)給藥量，0.5%羧甲基纖維素鈉空白滴丸組灌胃等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉空白滴丸溶液。將劑量組間比定為1:0.7。每籠5 只灌胃給藥后正常飼養(yǎng)。給藥0-2 h，每15 min觀察1次；給藥后2-4 h，30 min觀察1次；給藥后4-8 h，1 h觀察1次；給藥后8-24 h，4 h 觀察 1 次；從第 2 天起，每天觀察 1 次。稱(chēng)取體重，觀察各小鼠的動(dòng)度進(jìn)食、飲水情況及14天內(nèi)可能出現(xiàn)的動(dòng)度、異常肌肉運(yùn)動(dòng)、對(duì)外反應(yīng)、瞳孔改變、異常分泌物、大小便異常、眼球凸出、眼瞼下垂、呼吸異常、皮膚顏色改變等的毒性反應(yīng)和死亡情況。若有小鼠死亡，則將死亡小鼠解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、小腸等臟器的改變。

1.3 抑菌試驗(yàn)

1.3.1 菌液制備

將原菌種接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，連續(xù)傳代2次。取新鮮的菌胎采用密集劃線法轉(zhuǎn)接在普通瓊脂培養(yǎng)基平皿中，將接種后的平皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，隨后將5 mL 滅菌的肉湯培養(yǎng)基倒入普通瓊脂培養(yǎng)基上，用滅菌的接種環(huán)洗脫菌胎，制備成菌液，將該肉湯菌液轉(zhuǎn)入到無(wú)菌的試管中，放入4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 金黃色葡萄球菌的制備

取按照2.2.1方法制備的金黃色葡萄球菌液10 μL溶于5 mL 的生理鹽水中與0.5 麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷幔贸鲈摼旱臐舛葹? × 108。按照標(biāo)準(zhǔn)比濁后的標(biāo)準(zhǔn)指數(shù)，將原菌液稀釋成為1×109，待用。

1.3.3 耐青霉素金黃色葡萄球菌的制備

取按照2.2.1 方法制備的耐青霉素金黃色葡萄球菌液70 μL 溶于5 mL 的生理鹽水中與0.5 麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷幔贸鲈摼旱臐舛葹?×108。按照標(biāo)準(zhǔn)比濁后的標(biāo)準(zhǔn)指數(shù)，將原菌液稀釋成為1×109，待用。

1.3.4 體外抑菌試驗(yàn)

取10 支滅菌且配有棉塞的試管，1-10 號(hào)每管先加入無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基2 mL，然后在第1 管中加入配好濃度的滅菌受試藥物2 mL，混勻后用吸取2 mL 放入第 2 管中，依次稀釋到第 8 管，取出 2 mL 棄用；第 9 管不加藥物加2 mL 空白滴丸溶液，作為陽(yáng)性對(duì)照；第10管中加受試藥物2 mL 混勻，不加細(xì)菌，取出2 mL 棄去，作陰性對(duì)照。

將肉湯培養(yǎng)6-8 h 的實(shí)驗(yàn)菌液（耐青霉素金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌），用無(wú)菌肉湯將菌液稀釋成1×10-3。取0.1 mL 分別加入1-9 管中混勻，放入37℃孵箱中孵育16 - 18 h。18 h 后，第9 管細(xì)菌生長(zhǎng)溶液渾濁（陽(yáng)性對(duì)照），第10 管無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)呈透明狀（陰性對(duì)照），在此基礎(chǔ)上，觀察其它試管的細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.3.5 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)

（1）分組

健康SPF 級(jí)昆明小鼠120 只，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為受耐青霉素金黃色葡萄球菌感染和受金黃色葡萄球菌感染的線葉菊黃酮滴丸高、中、低劑量組，空白滴丸組，模型組和阿莫西林組，各6組。模型組給予生理鹽水，空白滴丸組給予溶于0.5%的羧甲基纖維素鈉的空白滴丸溶液10 g·(kg·天)-1，阿莫西林組給予0.1 g·(kg·天)-1，高、中、低劑量組分別給予 16、8、4 g·(kg·天)-1的線葉菊黃酮滴丸羧甲基纖維素鈉溶液。

（2）死亡保護(hù)率的測(cè)定

將不同密度的菌的混懸液分別腹腔注射于體重20±2 g 的昆明種小鼠，每個(gè)密度組 6 只，每只 0.5 mL，觀察小鼠72 h 內(nèi)的死亡情況，選用引起小鼠近100%死亡的菌液濃度進(jìn)行藥物防治試驗(yàn)。由預(yù)實(shí)驗(yàn)得出濃度在1×109時(shí)小鼠的死亡率達(dá)到90%。故以此細(xì)菌的濃度給各組小鼠進(jìn)行腹腔注射，每只0.5 mL。于注射菌液的前一天及注射菌液后的0、6、12、24 h 治療組和阿莫西林組灌胃給藥，模型組給0.5%的羧甲基纖維素鈉空白滴丸溶液，觀察72 h。計(jì)算死亡率和死亡保護(hù)率。（死亡率=死亡動(dòng)物數(shù)/動(dòng)物總數(shù)，死亡保護(hù)率=1-死亡率）

1.3.6 免疫試驗(yàn)

（1） 分組及給藥方式

取昆明種小鼠60 只，按體重隨機(jī)分為模型組、空白滴丸組、陽(yáng)性對(duì)照組(貞芪扶正顆粒)及線葉菊黃酮滴丸的高、中、低劑量組，每組10 只，共6 組。每天灌胃給藥1次，模型組給予生理鹽水，空白滴丸組給予溶于0.5%的羧甲基纖維素鈉的空白滴丸溶液10 g·(kg·天)-1，陽(yáng)性對(duì)照組給予貞芪扶正顆粒3 g·(kg·天)-1，高、中、低劑量組分別給予16、8、4 g·(kg·天)-1的線葉菊滴丸，連續(xù)灌胃給藥21天。

（2）雞血紅細(xì)胞的制備

成年雄雞，取抗凝的雞血10 mL，加入50 mL 生理鹽水,離心洗滌 3 次，前兩次離心 5 min，1000 r·min-1，第三次離心 10 min，1000 r·min-1，棄上清，制成壓積血。吸壓積血2 mL 加入198 mL 生理鹽水中混勻，制備1%雞紅細(xì)胞懸液。

（3）小鼠外周血液T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

在21 天給藥結(jié)束后，取小鼠尾部末梢血制片，晾干經(jīng)甲醛固定細(xì)胞后，用吉姆薩-瑞特染色4 min，隨后滴加PBS 液6 min，用大量水沖洗，晾干，封片。40倍油鏡下計(jì)數(shù)，達(dá)100個(gè)淋巴細(xì)胞后，計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率=過(guò)渡型母細(xì)胞/100 淋巴細(xì)胞數(shù)）。

1.3.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)

在21 天給藥及小鼠尾部末梢取血7 h 后，每只小鼠腹腔注射1%雞紅細(xì)胞懸液0.5 mL，輕揉腹部，30 min后將小鼠脫頸椎處死,剖開(kāi)腹腔，加3 mL 無(wú)鈣鎂的Hangk's液，輕揉1 min，吸取腹腔液約2.5 mL于離心管離心，500 r·min-1，3 min；棄上清，吸取 200 μL 滴于玻片上，涂抹均勻，晾干用甲醛固定。吉姆薩-瑞特染色4 min 后，加PBS，反應(yīng)6 min，用大量水清洗。在40倍油鏡下觀察，計(jì)算吞噬百分率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠急性毒性

小鼠急性毒性試驗(yàn)按0.04 mL·g-1小鼠體重灌胃給藥1 次，對(duì)照組給予同體積0.5%羧甲基纖維素鈉空白滴丸溶液灌胃。在24 h 內(nèi)，僅線葉菊黃酮滴丸1 組有1只小鼠出現(xiàn)抽搐、腹瀉、毛色不順滑最終死亡的現(xiàn)象，死亡小鼠尸檢主要器官肉眼未見(jiàn)病理改變。其余各組沒(méi)有小鼠死亡。在隨后的14天連續(xù)觀察，無(wú)一小鼠死亡。第15 天將其余小鼠解剖未見(jiàn)異常。因此不需測(cè)定LD50，改為測(cè)定MTD。根據(jù)線葉菊黃酮滴丸各組的給藥劑量，計(jì)算其MTD 值得16 g·kg-1。小鼠灌胃給藥16 g·kg-1相當(dāng)于70 kg的成人24 h 內(nèi)食用121.1g的線葉菊黃酮滴丸。相當(dāng)于臨床成人用藥的100倍。上述研究結(jié)果表明該線葉菊黃酮滴丸屬于實(shí)際無(wú)毒（≥ 5000 mg·kg-1）藥物。

表1 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

表2 線葉菊黃酮滴丸對(duì)感染金葡菌和耐藥金葡菌小鼠的保護(hù)作用

2.2 體外抑菌試驗(yàn)

采用試管法進(jìn)行的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，從未生長(zhǎng)細(xì)菌的各管內(nèi)吸取0.1 mL 培養(yǎng)物，接種于瓊脂平板培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)24 h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度即為線葉菊黃酮滴丸的最低殺菌濃度。線葉菊黃酮滴丸對(duì)金黃色葡萄球菌的藥物濃度比例為1∶8，即最低抑菌濃度為12.5 mg·mL-1；對(duì)耐青霉素金黃色葡萄球菌的藥物濃度比例為1∶16，即最低抑菌濃度為6.25 mg·mL-1。說(shuō)明線葉菊黃酮滴丸在體外抗耐青霉素金黃色葡萄球菌的效果良好（表1、圖1）。

2.3 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)

24 h后感染了金黃色葡萄球菌、耐青霉素金黃色葡萄球菌的模型組的小鼠全部死亡。繼續(xù)觀察至72 h，其余小鼠并未出現(xiàn)死亡（表2）。

體內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果從表2 可以看出，線葉菊黃酮滴丸高、中、低劑量組均對(duì)感染金黃色葡萄球菌和耐青霉素金黃色葡萄球菌的小鼠有保護(hù)作用，且中劑量組優(yōu)于高劑量和低劑量組，阿司匹林組對(duì)金黃色葡萄球菌感染的小鼠有較高的保護(hù)作用，但對(duì)耐青霉素金黃色葡萄球菌基本無(wú)保護(hù)作用，故線葉菊黃酮滴丸對(duì)感染金黃色葡萄球菌和耐青霉素金黃色葡萄球菌的小鼠具保護(hù)作用。

圖2 T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化對(duì)比圖

2.4 免疫試驗(yàn)

小鼠外周血液T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞經(jīng)吉姆薩-瑞特染色后40 倍油鏡下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。小鼠的外周血液淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率的結(jié)果見(jiàn)表3、表4。線葉菊黃酮滴丸高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組優(yōu)于線葉菊黃酮滴丸的低劑量組（P＜0.05），中劑量組與低劑量組比較差異不顯著，線葉菊黃酮滴丸高、中、低劑量組與模型組差異顯著（P＜0.05），表明線葉菊黃酮滴丸具有提高免疫的作用。

表3 線葉菊黃酮滴丸對(duì)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響（n = 10,)

表3 線葉菊黃酮滴丸對(duì)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響（n = 10,)

注：與模型組比較，△P ＜ 0.05；與低劑量組比較，*P ＜ 0.05

T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率/%67.07± 1.36△*60.03± 1.52△*56.03± 1.45△*61.00± 1.49△*32.00±1.34 34.07±1.41劑量（g·(kg·天)-1）16分組線葉菊黃酮滴丸高劑量組線葉菊黃酮滴丸中劑量組線葉菊黃酮滴丸低劑量組陽(yáng)性對(duì)照（貞芪扶正顆粒）空白組(0.5%CMCNa)模型組8 4 3 10等容量的生理鹽水

表4 線葉菊黃酮滴丸對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率的影響（n = 10,）

表4 線葉菊黃酮滴丸對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率的影響（n = 10,）

注：與模型組比較，△P ＜ 0.05；與低劑量組比較，*P ＜ 0.05

巨噬細(xì)胞吞噬率/%60.73± 1.27△*55.27± 1.31△*42.47± 1.71△*60.29±1.26△*31.27±1.21 30.53±1.12分組線葉菊黃酮滴丸高劑量組線葉菊黃酮滴丸中劑量組線葉菊黃酮滴丸低劑量組陽(yáng)性對(duì)照（貞芪扶正顆粒）空白組(0.5%CMCNa)模型組劑量/(g·(kg·天)-1)16 8 4 3 1 0等容量的生理鹽水

3 討論

近年來(lái)，隨著大量抗生素的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用，MRSA 居醫(yī)院內(nèi)、外感染病原菌首位[12,13]，并在 90 年代迅速擴(kuò)散。由于耐青霉素金黃色葡萄球菌對(duì)多種抗菌藥物具有廣泛耐藥性，對(duì)其可用的僅為萬(wàn)古霉素等糖肽類(lèi)抗菌藥物，但該類(lèi)藥物毒副作用較大，臨床應(yīng)用受到限制。隨后又相繼出現(xiàn)了完全耐萬(wàn)古霉素的耐青霉素金黃色葡萄球菌[14-17]，這就使得臨床上治療耐青霉素金黃色葡萄球菌感染可選用的藥物變得越來(lái)越少。

田應(yīng)彪[18]等結(jié)果表明 16 種中藥對(duì) MRSA 和 SA 均有不同程度的抑制作用，其敏感性無(wú)顯著性差異。本研究結(jié)果表明，線葉菊黃酮滴丸對(duì)MRSA和SA均有良好的抑制作用；對(duì)感染MRSA 和SA 的小鼠具保護(hù)作用，而阿司匹林僅對(duì)SA 感染的小鼠有效。小鼠外周血液淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率實(shí)驗(yàn)表明，線葉菊黃酮滴丸具有提高免疫力的功能。同時(shí)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，線葉菊黃酮滴丸無(wú)毒。

綜上所述，本研究將線葉菊黃酮制成滴丸進(jìn)行了初步藥效學(xué)研究，驗(yàn)證了線葉菊黃酮滴丸的臨床療效并且提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，為民族藥抗菌新藥的研制奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)為臨床治療細(xì)菌耐藥提供了新的思路，對(duì)中藥控制MRSA感染有重要的實(shí)際意義。但是線葉菊黃酮抗菌機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。