基于網(wǎng)絡藥理學與化學成分研究的連花清瘟膠囊治療新型冠狀病毒肺炎作用機制探討＊

王旭杰 ，張菀桐 ，王妙然 ，周忠陽 ，4，朱寶琛 ，李嘉茜 ，張 蕊 ，3，張雪雪 ，李秋艷 ＊＊，翁維良

（1. 中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091；2. 中國中醫(yī)科學院研究生院，北京 100700；3. 北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；4. 密云區(qū)北莊鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務中心，北京 101503；5. 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100070）

自2019 年12 月至今，由嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2 型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染人體后所致的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）的感染人數(shù)與死亡人數(shù)均在全世界范圍內飛速激增，對人類社會造成巨大的沖擊，導致的損失不可估量。世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）已將本病定義為全球大流行病，COVID-19 也是人類歷史上首次面對的由冠狀病毒引發(fā)的大流行病[1]。

面對疫情來襲，中國積極主動地履行著國際責任，與國際社會共同攜手為抗擊新冠肺炎疫情付出了諸多堅實行動[2]。隨著對COVID-19 治療經(jīng)驗的積累以及對疾病臨床表現(xiàn)與病理情況認識的逐步深入，中國在不斷探索著治療新冠肺炎的有效診療方案[3]。在中醫(yī)治療方面，連花清瘟膠囊可用于治療輕型與普通型肺炎引起的咳嗽發(fā)熱、乏力癥狀。連花清瘟膠囊（Lianhua Qingwen Capsule，LQC）是以中醫(yī)學理論為指導，由治療外感病證的中醫(yī)名方融合化裁而成，方中內含炙麻黃、炒苦杏仁、石膏、連翹、金銀花、板藍根、魚腥草、綿馬貫眾、廣藿香、紅景天、大黃、薄荷腦與甘草共13味中藥，具有清瘟解毒，宣肺泄熱的功效[4]。多項臨床研究表明[5-8]，參照《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》給予輕型、普通型新冠肺炎患者西醫(yī)抗病毒、對癥治療、抗生素藥物與營養(yǎng)支持等常規(guī)治療的基礎上，聯(lián)合使用連花清瘟能夠提高治療效果，可明顯改善發(fā)熱、咳嗽、胸悶、乏力等臨床癥狀，同時還能調節(jié)外周血中炎癥因子的表達，降低轉重癥率，對于治療新型冠狀病毒肺炎具有十分積極的意義。由于目前連花清瘟膠囊治療COVID-19 與防治SARSCoV-2 的潛在機制尚不明確，故本研究以連花清瘟膠囊所含化學成分與入血成分研究為基礎，借助網(wǎng)絡藥理學與分子對接等方法對其治療新冠肺炎的潛在活性成分與作用靶點進行相關驗證分析并預測可能的作用機制，為深入探索LQC 治療COVID-19 提供具有研究價值的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 連花清瘟膠囊中活性化合物的收集與篩選

本研究的納入文獻采用凝膠、硅膠柱色譜，中低壓色譜和高壓制備液相色譜等多種色譜方法對連花清瘟膠囊進行分離與純化，分別從連花清瘟膠囊孔樹脂70%、50%與30%乙醇洗脫部分分離化合物，并依據(jù)波譜數(shù)據(jù)和理化性質進行結構鑒定[9-11]。入血成分研究則采用UPLC-Q-TOF-MS 技術，根據(jù)質譜裂解規(guī)律、色譜波峰的保留時間、對照品信息并結合文獻對連花清瘟膠囊灌胃給藥后的大鼠血漿內所含入血成分進行分析[12]。

1.2 潛在靶點的預測

借助中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）與STITCH（https:////stitch.embl.de/）數(shù)據(jù)庫檢索化合物成分中靶點蛋白信息，使用UniProt（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫進行相關轉化，找出連花清瘟膠囊中各組分的基因靶點。本研究所選擇的數(shù)據(jù)庫雖有藥物和藥理學數(shù)據(jù)不夠齊全等局限性，但整體具備較高的準確性與查全性，TCMSP數(shù)據(jù)庫與STITCH 數(shù)據(jù)庫中的靶點信息均來源自已驗證的藥物成分-靶點信息，而對于沒有實驗數(shù)據(jù)支持的信息，TCMSP 采用當前全球最大規(guī)模的加權系綜相似度（weighted ensemble similarity，WES）模型進行高精度預測，STITCH 則通過對包括MEDLINE、PubMed Central 資源在內的文本信息挖掘與基于結構的預測方法進行補充，最終選取親和力最高的組合，作為全球蛋白質知識中心的UniProt 數(shù)據(jù)庫的信息結合了已審核的UniProtKB/Swiss-Prot 條目和未審核的UniProtKB/trembl條目，前者已由生物信息專家采集團隊添加數(shù)據(jù)，后者由自動化系統(tǒng)注釋[13-16]。以UniProt數(shù)據(jù)庫操作為例：采用UniProt 數(shù)據(jù)庫中UniProtKB 搜索功能，輸入蛋白名稱（protein name）并限定物種為人（Homo sapiens），篩選已檢閱文件（Reviewed），將檢索蛋白校正為其官方名稱（Official Symbol），摘錄標準基因名，獲取準確的靶點信息。

1.3 COVID-19相關靶點的收集

在 GeneCards（https://www.genecards.org/）、DisGe NET（http://www.disgene-t.org/）、以及UniProt 數(shù)據(jù)庫中輸入 COVID-19、SARS-CoV-2、2019-nCoV 等關鍵詞收集新冠肺炎相關靶點，同時在PubMed（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索SARS-CoV-2 病毒全基因組信息。匯總各數(shù)據(jù)庫靶點信息為excel 表格，待后續(xù)分析。

1.4 核心靶點網(wǎng)絡構建及靶點PPI網(wǎng)絡分析

將連花清瘟膠囊的有效成分、作用靶點信息與COVID-19 的靶點信息導入Cytoscape 3.7.2，使用Merge 功能篩選出LQC 中藥物成分對新冠肺炎的作用靶點，繪制有效成分-核心靶點網(wǎng)絡圖（Components-Targets Network）分析LQC 治療新冠肺炎的作用靶點。將最終篩選出的核心作用靶點信息導入STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫進行PPI 網(wǎng)絡構建與數(shù)據(jù)分析。

1.5 KEGG通路與GO功能富集分析

Cytoscape 軟件的插件ClueGo[17]整合了京都基因和基因組百科全書（KEGG）相關數(shù)據(jù)。本研究采用ClueGO 對獲得的核心靶點進行KEGG 信號通路以及GO富集分析，探索LQC治療COVID-19的關鍵信號通路與生物學過程。

1.6 核心成分分子對接

登陸 RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載人類血管緊張素轉化酶II（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）與 SARS-CoV-2 S 蛋白受體結合域3D 結構PDB 文件（PDB:6M0J）。使用PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載核心藥物成分3D 結構 mol2 格式文件。運用 AutoDockTools 1.5.6 軟件對蛋白質進行加氫、去水等操作，并將化合物與靶蛋白文件格式轉換為pdbqt 格式。使用Autodock Vina軟件將受體與配體進行半柔性對接，如果結合能小于0 kj·mol-1則表明可自發(fā)結合，本研究選取結合能≤-5.0 kj·mol-1作為篩選依據(jù)[18]。

2 結果

2.1 連花清瘟膠囊有效化合物情況

由于許多傳統(tǒng)中藥制劑存在活性成分生物利用度低、口服吸收差的特點，同時中藥復方制劑與中藥單體內所含有效成分亦有區(qū)別，基于科研數(shù)據(jù)平臺，以口服生物利用度≥30%來篩選中藥單體活性成分，會導致遺漏很多活性分子，故本研究選擇根據(jù)對連花清瘟膠囊的化學成分研究及血清藥物化學研究選取相關化合物[19,20]。最終明確連花清瘟膠囊內共計64 個目前已知的化學成分與入血成分，其中化學成分研究結果包括46 個有效成分，入血成分研究結果包括22個有效成分，二者共有4 個相同成分。使用CytoScape軟件繪制連花清瘟膠囊有效成分網(wǎng)絡圖（圖1）。

2.2 有效化合物相關靶點信息

使用TCMSP 以及STITCH 數(shù)據(jù)庫收集上述64 個化學成分信息后使用UniProt 將相關靶點蛋白信息轉化為基因靶點信息，進行數(shù)據(jù)匯總分析后，最終得到25 個有效成分（包括連翹脂素、異甘草素、大黃素、大黃酸、山奈酚、槲皮素等成分）的共計146 個潛在靶點信息，使用CytoScape 軟件繪制化合物-靶點信息網(wǎng)絡圖，詳見圖2。（注：藍色為有效成分信息，紅色為作用靶點信息。）

2.3 COVID-19的相關靶點信息

新冠肺炎為當前的研究熱點，各數(shù)據(jù)庫均有相關信息發(fā)布，如UniProt 數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)目前設有SARSCoV-2 信息專欄（COVID-19 UniProtKB）。本研究分別從GeneCards、UniProt、DisGeNET、PubMed 數(shù)據(jù)庫搜索匯總COVID-19相關靶點信息，經(jīng)過匯總計算后，共得到相關靶點122 個，其中包括了SARS-CoV-2 的S、N、M蛋白等與ACE2、IL6、IL10、TNF、CCL2、TMPRSS2、ADAM17等靶點（圖3）。

2.4 連花清瘟膠囊治療COVID-19 的核心成分-靶點網(wǎng)絡及靶點PPI分析

運用Cytoscape 軟件將所獲活性成分及相關靶點信息與COVID-19 潛在作用靶點進行匯總分析，同時根據(jù)相關成分抗冠狀病毒感染的研究作為補充，構建核心藥物成分-靶點信息網(wǎng)絡模型（圖4）。（注：橙色為有效成分信息，綠色為作用靶點信息。）構建網(wǎng)絡模型中包含26個節(jié)點（node）和26條邊（edge），每條邊表示活性成分與作用靶點之間的關系，其中包括12個有效成分信息與14個作用靶點信息，核心作用靶點分別為IL6、IL10、TNF、CCL2、ACE2、DPP4 等。將核心靶點信息導入STRING平臺進行PPI網(wǎng)絡分析后，將所得結果導入CytoScape 繪制PPI 網(wǎng)絡圖，其中節(jié)點的大小表示重要程度，線條的粗細代表了作用力強弱，結果見圖5。

圖1 連花清瘟膠囊有效成分網(wǎng)絡圖

圖2 連花清瘟膠囊有效成分-靶點網(wǎng)絡圖

圖3 COVID-19靶點網(wǎng)絡圖

2.5 核心靶點KEGG 通路分析

KEGG 通路分析結果顯示（圖 6），IL-17 信號通路、RIG-I 樣受體信號通路、TNF 信號通路、AGERAGE 信號通路、瘧疾等感染性疾病信號通路以及類風濕關節(jié)炎等炎癥性疾病在連花清瘟膠囊治療COVID-19的過程中發(fā)揮了重要的作用。

2.6 核心靶點GO功能富集分析

將核心靶點信息導入ClueGo 進行GO 富集分析，結果發(fā)現(xiàn)：連花清瘟膠囊治療COVID-19 的核心靶點主要與IL-6 產(chǎn)生的負調控、B 細胞介導的免疫調節(jié)、調節(jié)免疫應答中涉及的細胞因子分泌以及受體生物合成過程等生物學過程有關，詳見圖7。

圖4 連花清瘟膠囊治療COVID-19核心成分-靶點網(wǎng)絡圖

圖5 連花清瘟膠囊治療COVID-19 PPI網(wǎng)絡圖

2.7 核心成分分子對接

目前，已有研究證明，連花清瘟膠囊在顯著抑制SARS-CoV-2在細胞中復制的同時，可顯著減少IL-6、CCL2、TNF-α 等促炎細胞因子的產(chǎn)生[21]。故本研究通過核心靶點信息情況篩選出大黃素、山奈酚、蘆薈大黃素與蘆丁作為四個核心藥物成分與相關受體進行分子對接研究。

Autodock Vina 對配體與受體進行半柔性對接后，結果顯示本研究選取的四個核心成分同與ACE2 結合的SARS-CoV-2 刺突蛋白受體結合域（spike receptor binding domain，RBD)的結合能分別為：大黃素（結合能-6.6 kj·mol-1）、山奈酚（結合能-6.8 kj·mol-1）、蘆薈大黃素（結合能-7.5 kj·mol-1）、蘆?。ńY合能-5.5 kj·mol-1）,分子對接情況見圖 8。

3 討論

連花清瘟膠囊中所含的多種藥物或有效成分在以往的研究中已被證明具有一定的抗冠狀病毒潛力與效果，同時臨床實踐證明，連花清瘟膠囊在治療輕型與普通型新冠肺炎患者方面的療效良好[8,22]。2020年4 月14 日，國務院聯(lián)防聯(lián)控機制新聞發(fā)布會公布，連花清瘟膠囊可明顯緩解COVID-19 患者的咳嗽、發(fā)熱與乏力等癥狀，同時能有效減輕癥狀輕轉重率，可用于新型冠狀病毒性肺炎的常規(guī)治療，國家藥監(jiān)局已批準將治療COVID-19納入到連花清瘟膠囊的藥品適應癥中[23]。

新冠肺炎屬中醫(yī)學“瘟疫”的范疇，人體外感疫毒之邪為主要病因，邪氣入里化熱則是重要的病機轉歸，與COVID-19 患者臨床以發(fā)熱為主要癥狀的表現(xiàn)相一致[8]。連花清瘟組方深刻體現(xiàn)出了中醫(yī)藥防治此類疫病豐富的治療經(jīng)驗，以古代名醫(yī)張仲景與吳鞠通在《傷寒論》和《溫病條辨》中所記載的麻杏石甘湯、銀翹散為基礎方，同時借鑒明代吳又可《瘟疫論》中“治疫易早下”的經(jīng)驗，故而展現(xiàn)出“清瘟解毒，宣肺泄熱”的功效。有研究發(fā)現(xiàn)[24]，多種傳染性疾病與中醫(yī)“熱證”有著密切聯(lián)系，熱證多與免疫因素相關，從新冠肺炎的發(fā)病特點與臨床表現(xiàn)可以判斷出本病基本屬于“熱證”，而連花清瘟對促炎細胞因子的調節(jié)，以及本研究發(fā)現(xiàn)的LQC 治療COVID-19 的核心作用靶點IL-6、IL-10、TNF 又屬于熱證網(wǎng)絡中的重要基因靶點，因此連花清瘟膠囊治療新冠肺炎不僅符合中醫(yī)學辨證論治的功效特點，還與現(xiàn)代醫(yī)學的疾病發(fā)生機制相契合。

圖8 核心成分與SARS-CoV-2刺突蛋白受體結合域分子對接模式

本文通過網(wǎng)絡藥理學技術，對連花清瘟膠囊內所含各藥物成分及入血成分所對應靶點等相關信息進行計算和預測，并通過數(shù)據(jù)庫與文獻查閱分析對比所得數(shù)據(jù)，經(jīng)過核對校驗后，筆者發(fā)現(xiàn)，連花清瘟膠囊中所含的大黃素、蘆薈大黃素、山奈酚、蘆丁等有效成分可能通過調節(jié)IL6、IL10、TNF、CCL2、MAPK14 等靶點起到調節(jié)免疫應答中涉及的細胞因子分泌、IL-6 產(chǎn)生的負調控以及B細胞介導的免疫調節(jié)等重要的生物調節(jié)進程，進而起到促進相關炎癥因子的消除，改善新冠肺炎患者的相關免疫學指標的積極療效。同時，作為核心作用靶點之一的DPP4 目前也被認為是預防并降低2型糖尿病患者感染新冠肺炎后出現(xiàn)急性呼吸道并發(fā)癥風險的重要潛在靶點之一，因此連花清瘟膠囊的作用可能比目前已知的范圍更為廣泛[25]。

對于KEGG通路富集結果，本研究認為，除炎癥因子相關信號通路外，RIG-I 樣受體介導的信號轉導通路（RIG-I-like receptor signaling pathway）亦需引起注意。該通路為人類體內重要的天然免疫抗病毒通路，在促炎因子與I型干擾素的產(chǎn)生及抗病毒感染的過程中至關重要,RIG-I 樣受體在識別RNA 病毒并誘導一系列抗病毒因子產(chǎn)生的過程中減輕了病毒對人體的危害[26,27]。很多RNA 病毒則通過不同策略阻斷RIG-I樣受體信號通路[28]，而SARS-CoV-2 與該通路間的調控關系則尚不清楚。對于連花清瘟膠囊治療COVID-19的作用機制，筆者認為LQC 除調控炎癥因子相關信號通路外，可能也參與了對RIG-I 樣受體信號通路的調控而激發(fā)出相應的抗病毒機制，借此發(fā)揮抑制SARS-CoV-2并減輕相關癥狀的作用。

有研究表明[29]，大黃素能通過阻斷SARS-CoV S蛋白與ACE2 間的相互作用而起到抗病毒的功效。SARS-CoV-2 的 RBD 區(qū) 域 結 構 與 SARS-CoV RBD 十分相似，二者存在許多相同的殘基，故本研究選取根據(jù)核心靶點信息情況篩選出的重要化合物成分，采取分子對接的方法對核心成分與該區(qū)域的關系進行探尋[30]。結果表明連花清瘟膠囊中所含有的大黃素、蘆薈大黃素、山奈酚與蘆丁可能通過與SARS-CoV-2 RBD 區(qū)域殘基相結合，阻斷病毒S 蛋白與ACE2 受體間的相互作用，從而達到抗病毒的功效。上述核心藥物成分已被證實具有明顯的抗炎作用，參與抑制促炎因子的轉錄，調控促炎酶的活性與相關炎癥基因、信號通路的表達，同時還可減輕對相關組織的病理損傷，因此連花清瘟對COVID-19 的治療作用很可能與之相關，而由于以上成分與SARS-CoV-2 刺突蛋白受體結合域結合能較強的發(fā)現(xiàn)，也為LQC 治療COVID-19 的機制研究提供了新的探索方向[31-34]。此外，TMPRSS2、cathepsin B/L、ADAM17、STAT3 等分子也是治療新冠肺炎的潛在靶點[35]。由于LQC組方對相關促炎細胞因子的調節(jié)作用以及有效成分山奈酚已被證實可通過調控Tyk-STAT 信號通路抑制STAT3 的激活以阻止炎癥的發(fā)生發(fā)展，因此本研究認為連花清瘟膠囊很可能也參與了對STAT3 與ADAM17 的調控以抑制炎性細胞因子的激活，但具體的調控機制尚需研究證明。

綜上所述，連花清瘟膠囊對新冠肺炎的治療具有多成分、多靶點的特點，能通過調控不同的生物進程與相關信號通路達到對COVID-19 的干預作用，同時在中醫(yī)學整體觀念與辨證論治理論的指導下，法因證立，方隨法出，藥依方遣，實現(xiàn)了對“疫病”新冠肺炎的治療效果[36]。連花清瘟膠囊能通過調節(jié)相關免疫因子及信號通路減輕COVID-19患者的炎癥反應并緩解癥狀，同時所含有效成分可能參與對RIG-I 樣受體信號通路的調節(jié)并與SARS-CoV-2 RBD 殘基相結合起到抗病毒的功效。中藥復方的成分眾多且復雜，相關作用機制與相關藥效團的研究始終是重點與難點，本研究尚有LQC 中所含的其余成分以及有待發(fā)掘的藥效團未加入分析之內，因此，連花清瘟膠囊治療COVID-19 的作用機制可能更加全面、復雜，對于何種成分以何種方式作用于靶點與參與通路調節(jié)的詳細機制等具體細節(jié)應當繼續(xù)加以深入研究[37]。在當前全球新冠肺炎疫情持續(xù)蔓延，SARS-CoV-2病毒發(fā)生突變、傳染性增強的背景下，中醫(yī)藥需要做出更大的貢獻，本研究運用網(wǎng)絡藥理學等方法從生物網(wǎng)絡的角度較好地解釋了LQC及COVID-19病證、方證間的關系，而基于網(wǎng)絡藥理學的作用機制研究也為連花清瘟膠囊治療新型冠狀病毒肺炎提供了重要的科學線索[38-40]。