基于網絡藥理學探討大柴胡湯對2型糖尿病的治療作用機制＊

趙 凱，許筱穎

（北京中醫藥大學中醫學院 北京 100029）

近年來，由于分子生物學以及各種先進的組學技術逐漸被應用到中醫藥的領域中，在藥理學分子作用機制研究和臨床應用中已經積累了大量的實驗研究數據[1]；隨著大數據時代的到來，深度挖掘和整合這些已有的中醫藥相關醫學數據，可以做到節約實驗資源，為下一步中醫藥現代化和新藥研發提供思路[2]。中醫復方往往由幾種至幾十種中草藥組成，每種草藥都包含了幾十種甚至上百種化學成分，因此由一張中醫復方制成的湯劑可能含有成百上千種化合物，不同的組分之間呈現出復雜的相互作用。中藥配伍的“七情”理論對不同中藥之間配伍可能出現的不同情況做出了很好的詮釋和歸納，如“相須”和“相使”表明兩種藥物會產生協同作用而增強療效，“相畏”和“相殺”會產生減毒的效果，如果兩種藥物“相反”則意味著將兩種藥同時使用會產生毒性。從現代藥理學的角度看“七情”理論，則可以認為是各草藥所含的化學物組分之間產生了相互作用。由于所含的化合物數量眾多且相互作用十分復雜，而通過提取分離的單一活性化合物和中藥復方的作用效果在實際中又相去甚遠，化合物和中醫配方之間存在很大的差異；雖然從中藥中提取單體制成的藥物也能取得巨大成功，例如從青蒿中發現了青蒿素，但是闡明中藥復方不同組分之間的相互作用及藥理機制仍是十分必要的，只通過傳統藥理學實驗的方法難以勝任。由于疾病具有復雜性，一種疾病可能同時涉及多個病理途徑，如內分泌系統疾病，一個病理途徑又與多個基因靶點和蛋白質相互作用有關。如糖尿病從開始胰島功能異常到最終出現各種并發癥，涉及多種途徑和多個系統，如果僅僅依靠單一成分單一靶點藥物去治療多靶點的疾病是不現實的[3]。

現代網絡藥理學通過網絡分析的方法尋找和構建藥物與疾病之間多靶點的作用關系，為闡明中藥復方的藥理機制和新藥發現提供了有利途徑[4]；有研究者就曾通過網絡分析發現了新的抗癌藥物[5]。近年來，網絡藥理學方法被廣泛引入到中醫藥領域的藥理及病理的研究和分析中，如通過網絡藥理學構建的梔子大黃湯治療肝病的網絡模型，找到了多個潛在的作用靶點及相應化合物[6]；通過結合基因、蛋白質等測序實驗數據，對芪參益氣方構建網絡模型進行分析，發現全方配伍使用的療效高于其中任何單一使用的藥味[7]。網絡藥理學方法與中醫“整體觀”“辨證論治”的思想不謀而合[8]，搭建起了傳統中醫藥和現代醫學之間溝通的橋梁[9]，網絡上開放獲取的中醫藥數據庫和多種組學數據庫，極大促進了多靶點藥物疾病網絡構建分析的便捷性。

糖尿病是我國常見的慢性代謝性疾病，據統計中國的糖尿病患者有1.14 億之多，又因為我國人口基數巨大，伴隨社會的逐漸老齡化趨勢，使我國成為了世界上的糖尿病大國，糖尿病防治成為了亟待解決的重大民生問題，如何有效防治糖尿病在當今仍然是醫學難題[10,11]。臨床上主要多見2 型糖尿病（Type 2 diabetes），2 型糖尿病大約占到了90%左右，除2 型糖尿病之外，還有1型糖尿病，特殊類型糖尿病和妊娠期糖尿病[12,13]。中醫復方具有“多組分、多靶點、多作用途徑”的特點以及中醫診療的整體觀和辨證論治思想，中醫藥在治療糖尿病方面有獨到之處，值得深入研究和挖掘。有研究者曾運用網絡藥理學的方法分析了葛根芩連湯治療糖尿病的分子網絡作用機制，并用實驗進一步驗證了其中的關鍵活性成分[14]。中醫經典《傷寒論》是中醫辨證論治思想的源頭，具有極高的學術地位，被歷代名家奉為圭臬。大柴胡湯是《傷寒論》中一首著名方劑，為小柴胡湯去人參加枳實、芍藥、大黃而成，去掉了人參之補，增加了宣通之力，主要功效是用于治療少陽和陽明合病，有和解少陽、內瀉里熱的作用。近年來，大柴胡湯的臨床應用得到了擴展和深化，廣泛用于治療胃腸道等消化系統疾病，并且對糖尿病及其并發癥和高脂血癥方面也有很好的效果[15]。有臨床研究表明，大柴胡湯治療超重2 型糖尿病與西藥二甲雙胍有類似的療效[16]。大柴胡湯改善了糖尿病患者的癥狀，降低了血糖和血脂等指標，值得臨床推廣使用[17]。由于大柴胡湯藥效成分復雜，其對糖尿病治療作用的分子機制仍不是很清楚。本文運用網絡藥理學和生物信息學方法直觀的分析大柴胡湯復方的作用機制，系統闡釋和挖掘中醫經典方劑大柴胡湯對2 型糖尿病的治療作用機理，以期為進一步的實驗研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 大柴胡湯和2型糖尿病潛在靶點檢索

首先將大柴胡湯中的8味中藥：柴胡、黃芩、白芍、半夏、枳實、生姜、大棗、大黃依次輸入中醫藥生物信息分析平臺SymMap[18]（https://www.symmap.org/search/），得到預測的大柴胡湯的有效化學成分和靶標，將大柴胡湯中的每味藥分別依次輸入到平臺中，設置搜索條件為P＜0.05。通過在CTD 數據庫[19]（Comparative Toxicogenomics Database, www. ctdbase. org）中 搜 索“Diabetes Mellitus,Type 2”，即可獲得預測出的2 型糖尿病有關的靶點，將其導入到Excel 表格中按“Inference Score”從高到低排序，保留具有直接證據的靶點。

1.2 藥物-疾病靶點篩選

通過預測獲得大柴胡湯的所有潛在靶點和2型糖尿病的相關靶點，將兩組數據分別輸入到韋恩圖繪制工具[20]（Calculate and draw custom Venn diagrams,http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）軟件中，即得到大柴胡湯和2 型糖尿病的重疊作用靶標，即為得到的藥物-疾病靶點。

1.3 藥物-疾病靶點相互作用網絡構建

將上述篩選出的大柴胡湯和2型糖尿病的共同作用靶點利用STRING（Protein-Protein Interaction Networks Functional Enrichment Analysis，www.string-db.org），構建蛋白質相互作用網絡（PPI網絡）。使用Cytoscape軟件[21]中的cytoHubba 插件[22]按照拓撲學規則計算關鍵節點，按照節點度Degree 排序得出PPI 網絡中排名前10的關鍵節點。

1.4 GO分析和KEGG通路富集分析

使用Cytoscape軟件中的CluGO[23]工具對上述得出的大柴胡湯和2 型糖尿病的靶點進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 功能分析是一種廣泛使用的基因功能注釋系統，而KEGG（京都基因與基因組百科全書）是基于基因組測序和大分子數據集生成的高通量技術數據庫資源。通過富集分析，可以找到大柴胡湯治療2型糖尿病的主要潛在生物學過程及作用信號通路。

2 結果

2.1 大柴胡湯治療糖尿病作用靶點

通過在數據庫上搜索結果顯示，發現大柴胡湯中8味藥物的全部潛在靶點有476 個，檢索到2型糖尿病的潛在靶點共有229 個。將大柴胡湯靶點和2 型糖尿病靶點取交集，發現存在41 個共同作用靶點，即INPPL1、PAM、HMOX1、HNF1A、NOS2、INS、PTPN1、PPARA、CYP1A2、PRKCB等等（圖1）。

2.2 蛋白質互作網絡構建和關鍵靶點篩選

通過STRING 對41 個大柴胡湯和2 型糖尿病的共同靶點進行蛋白質相互作用網絡分析，PPI 富集P值小于1.0e-16，結果差異具有統計學意義（圖2）。此PPI 共產生了41 個靶點和270 條邊，平均節點度（average node degree）為13.2，平均聚類系數為0.696，PPI 網絡富集的P＜1.0e - 16，既具有顯著統計學意義。STING數據庫可以揭示蛋白質與蛋白質之間的相互作用關系，圓形節點表示每個已知的由基因編碼的蛋白質，節點之間的邊表示兩者的關系。邊的不同顏色代表相互作用的證據類型，如來自實驗的證據或者文獻證據，邊的顏色越多說明獲得支持的證據越多。用degree（度中心性）表示某個節點與該網絡中其他節點的連接數，degree 越高說明該節點與其他靶點之間的相互作用越廣泛。對構建出的互作網絡使用Cytoscape 軟件中的cytoHubba 進行分析，按節點度Degree 進行排序發現排名前10 個關鍵節點為INS（胰島素）、TNF（腫瘤壞死因子）、CAT（過氧化氫酶）、PPARG（過氧化物酶體增殖物激活受體r）、CASP3（caspase-3）、ADIPOQ（脂聯素）、NOS3（一氧化氮合酶3），HMOX1(血紅素加氧酶 1)、UCP2（解偶聯蛋白酶2）、GCG（胰高血糖素），節點顏色越深表明排名越靠前，節點越大表明節點度越高（圖3）。

2.3 藥物-疾病作用靶點GO功能分析

使用CluGO工具對此41個靶點進行GO生物過程功能富集分析，為了得到更精確的結果，設置Kappa Score 為0.4，選擇設置P值小于0.01，合并相似的GO術語，最終共獲得79 個生物過程功能富集，并按照Kappa 值分為了12 類（表1）。涉及的生物過程包括：小分子代謝過程的正調控、凋亡信號通路的負調控、對維生素的反應、對糖皮質激素的反應、對生物堿的反應、細胞排毒、對尼古丁的反應、葡萄糖跨膜轉運、死亡域受體的信號通路、外在凋亡的負調控、調節胰島素分泌、葡萄糖穩態、胰島素受體信號通路的調節。其中涉及到多個與糖尿病相關的生物學過程。

圖1 大柴胡湯-2型糖尿病的共同作用靶點預測

圖2 大柴胡湯-2型糖尿病共同作用靶點的PPI網絡構建

圖3 PPI網絡中前10個關鍵節點

2.4 藥物-疾病作用靶點KEGG通路富集分析

運用CluGO 工具對41 個作用靶點進行KEGG 信號通路富集分析，設置Kappa 值為0.4，設置P值小于0.01，共獲得個41條信號通路的富集結果，按照Kappa值劃分為了7類（圖7）。這些信號通路主要涉及了：胰島素抵抗、長壽調節途徑、青少年的成年人型糖尿病、碳水化合物的消化吸收、2型糖尿病、胰島素信號通路和PPAR 信號通路（表2）。可知其中包含了多個與2型糖尿病的相關信號通路。除了7條主要的信號通路外，其他還參與了胰島素信號通路、胰高血糖素信號通路、AMPK 信號通路、NF-κB 信號通路、鞘脂信號通路、p53 信號通路、細胞凋亡、RIG-I 樣受體信號通路、IL-17 信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路等（圖6）。

2.5 大柴胡湯治療2型糖尿病的活性化學成分篩選

通過在TCM-BATMAN[24]數據庫中檢索大柴胡湯中的藥物共得到活性成分474 個，其中柴胡有82 個化學成分，黃芩有65 個化學成分，白芍有35 個化學成分，半夏有31 個化學成分，大黃有58 個化學成分，大棗有49 個化學成分，生姜有133 個，枳實有21 個。胰島素抵抗（Insulin resistance）、2 型糖尿病（Type 2 diabetes）、胰島素信號通路（Insulin signaling pathway）是3 條大柴胡湯治療糖尿病主要參與的信號通路（表2），進而繪制出這3 條主要信號通路上的靶點（圖9）。這些靶點在大柴胡湯中所對應的各活性化學成分（圖10）和大柴胡湯8 味草藥中與參與上述3 條信號通路所對應的主要活性化學成分（圖8、表3）。

3 討論

圖4 大柴胡湯-2型糖尿病作用靶點GO生物過程富集分析

圖5 GO生物過程富集分析各部分所占比例

糖尿病是一種以高血糖為特征的內分泌疾病，主要由胰島素分泌缺乏引起。胰島素是一種重要的內分泌激素，胰島素分泌以及胰島功能失常還有可能伴隨或引起其他內分泌激素分泌的失調[25]。本研究通過SymMap 和CTD 疾病數據庫篩選出大柴胡湯中存在多個對2 型糖尿病直接作用的靶標，并且從PPI 網絡計算得知，節點度最高的是編碼胰島素的靶點INS（胰島素）；在GO 功能分析中，也顯示大柴胡湯參與了葡萄糖跨膜轉運、調節胰島素分泌、葡萄糖穩態、胰島素受體信號通路的調節等生物過程；通過KEGG富集分析，可以看出大柴胡湯的作用靶點直接參與調控了胰島素抵抗、2 型糖尿病、胰島素信號通路、胰高血糖素信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路等與2型糖尿病的發病機制直接密切相關的信號通路。說明了大柴胡湯治療糖尿病的分子生物學機制可能是直接參與了對胰島素的分泌調控，從而調節血糖。有臨床研究顯示，大柴胡湯能明顯降低2 型糖尿病患者的血糖[26]，改善?細胞功能，減輕胰島素抵抗[27]，增加對血糖穩態的調控[28]。從圖8 中可以發現，大柴胡湯治療2型糖尿病的活性化學成分主要集中在柴胡、半夏、生姜、白芍和大黃五味草藥中。從圖9中可以看出，在3 條主要的通路上又以在胰島素抵抗（Insulin resistance）這條通路上富集的靶點最多。從圖10的大柴胡湯成分靶點網絡中可以得出，與INS、TNF 和PRKCB 3 個靶點相關聯的大柴胡湯中的化學成分最多。

圖6 大柴胡湯-2型糖尿病作用靶點PPI網絡KEGG信號通路富集分析

圖7 大柴胡湯-2型糖尿病作用靶點網絡的主要信號通路各部分比例

表2 大柴胡湯對2型糖尿病治療靶點KEGG信號通路富集分析

圖8 大柴胡湯治療2型糖尿病草藥-成分-靶點網絡（1）

大柴胡湯君藥為柴胡，《神農本草經》記載“柴胡，主心腹，去腸胃中結氣，飲食積聚，寒熱邪氣，推陳致新”，柴胡的功效與大柴胡湯的功效基本一致。大柴胡湯主治病邪在少陽不解兼入陽明，化燥成實而出現嘔不止、心下急、郁郁微煩等癥，既能夠清解郁熱，又能下陽明里實，為表里雙解之劑；糖尿病在中醫學被稱為“消渴”，多認為是由于飲食不節和情志失調導致，治療常以滋陰清熱為主，大柴胡湯能疏轉少陽樞機，開達少陽之郁，故能顯效。有中醫學者認為，現代醫學定義的糖尿病不能與我國古代的“消渴”證完全對應，不是所有的糖尿病患者都會出現“消渴”的三多癥，而應該針對具體病癥具體分析[29]，現代人多嗜食肥甘厚膩，如臨床上糖尿病患者常伴有高血脂和肥胖，中醫辨證多為氣滯痰濁血瘀體質，有的患者還會伴有易怒急躁或抑郁等情志異常表現，這些基本病機形成了糖尿病發病的土壤。大柴胡湯能疏暢三焦氣機，化濁通腑，有專家用大柴胡湯來治療包括糖尿病、肥胖、高血壓、高血脂等多種代謝性疾病[30]。這些疾病都存在氣滯和膏濁內蘊的相似病機，中醫的病機理論和中醫所認為的疾病背后的本質可能和現代分子生物學機制存在一定聯系[31]，正如本文通過分析大柴胡湯治療糖尿病的通路機制，發現其能直接參與調控胰島素的分泌及其相關的多條信號通路。通過上述預測篩選出的靶點和通路機制很可能是在大柴胡湯治療糖尿病發揮療效的過程中起著非常重要的作用。

表3 大柴胡湯治療2型糖尿病主要活性化學成分

本研究基于網絡藥理學的方法，對大柴胡湯治療2 型糖尿病的作用靶點和通路進行了預測篩選和分析，與以往的研究結果相互印證，為進一步的實驗研究提供了參考方向和理論基礎。初步揭示了大柴胡湯作用于2 型糖尿病的多靶點、多機制的復雜網絡機制。但由于網絡藥理學和互聯網數據庫的局限性，還不能完全表達中醫復方有效成分相關作用機制，結合網絡藥理學的分析結果仍需后續體內體外實驗的觀察與驗證。

圖9 大柴胡湯治療2型糖尿病草藥-成分-靶點網絡（2）

圖10 大柴胡湯治療2型糖尿病草藥-成分-靶點網絡（3）