基于膠質細胞增殖調控因子bFGF/TGF-β1探討逍遙散治療抑郁癥的機制＊

劉 燕，吳耀松，楊鐵柱，白 娟，寇美靜，史占江，陳玉龍＊＊

（1. 河南中醫藥大學中醫藥科學院/河南省方證信號傳導實驗室 鄭州 450046；2. 河南中醫藥大學基礎醫學院 鄭州 450046；3. 河南省洛陽正骨醫院（河南省骨科醫院） 鄭州 450016；4. 河南中醫藥大學研究生院 鄭州450046；5. 湖北中醫藥大學基礎醫學院 武漢 430065）

抑郁癥（Depression，MDD）是一種以抑郁心境自我體驗為中心的臨床癥狀群或狀態，主要表現為心情低落、思維遲緩、認知功能障礙、意志行為活動減退、軀體癥狀等[1,2]。據統計，抑郁癥已成為威脅人類健康的第四大疾患。越來越多的研究表明，抑郁癥的發生與社會心理應激密切相關。然而，迄今為止，壓力應激導致行為障礙的機制仍不清楚。通過本報道資助課題研究以及相關中樞神經病學研究和臨床研究報道，大腦皮層和海馬是重要的情緒活動調控系統，其功能異常或障礙可能是應激致病的主要原因[2]。

研究顯示，抑郁癥患者腦內病變主要涉及大腦皮層和海馬腦區的星形膠質細胞（astrocytes，AST）形態、功能、可塑性的改變[3]。另外，本團隊在上述課題研究的基礎上發現抑郁癥小鼠模型前額皮質AST 與谷氨酸轉運體EAATs 的功能損害既是抑郁癥的結果又是促進其發展的重要因素[4]。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是它是正常上皮細胞和星形膠質細胞增殖的強抑制劑。有趣的是，有研究顯示TGF-β1 具有調節行為的作用[5]，然而，關于抑郁癥的發生中，TGF-β1 的表達變化和作用的報道具有不一致性。有研究顯示慢性應激時，海馬內注射TGF-β1 能逆轉大鼠抑郁行為，又有研究顯示抑郁病人血漿中TGF-β1 含量增加[6,7]。堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）表達主要集中于AST 中，其功能主要是促進AST 肥大和增生，是一種重要的促星形膠質細胞活化因子。研究顯示前額皮質、海馬和紋狀體bFGF 表達增強可顯著改善抑郁狀態[8]。

大量的臨床和實驗研究表明，宋代《太平惠民和劑局方》中逍遙散在抑郁癥治療方面顯示了明顯的優越性，關于其治療機制目前已有大量研究者做出了相關探索，但大部分研究均聚焦于逍遙散對抑郁癥患者或模型大腦中樞神經元的調節和保護作用，而從抑郁癥患者或動物模型中樞膠質細胞功能開展逍遙散治療抑郁癥機制的研究甚少。本研究基于探索星形膠質細胞抑制和激活因子TGF-β1 和bFGF 的表達進一步證實星形膠質細胞參與抑郁癥發生過程，并聚焦于逍遙散對抑郁癥小鼠星形膠質的重要調節因子TGF-β1 和bFGF 的調節作用，探討逍遙散治療抑郁癥的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

于北京維通利華實驗動物技術有限公司購買40只 10 周 齡 SPF 級 C57BL/6J 小 鼠（許 可 證 號 ：NO.11400700088123），按照隨機數字表法平均分為4組，分別為：正常組，模型組，氟西汀組、逍遙散組，所有小鼠飼養于SPF 級動物房（溫度22 ± 2℃，濕度30-40%）。除正常組外，其余各組小鼠均接受CUMS 方法造模。

1.2 實驗藥物

逍遙散顆粒劑（柴胡30 g，茯苓30 g，白術30 g，當歸30 g，白芍30 g，甘草15 g，干姜10 g，薄荷10 g）購于河南中醫藥大學第三附屬醫院。鹽酸氟西汀膠囊為蘇州中化藥品工業有限公司產品（規格：20 mg/粒，批號：20064844）。

1.3 給藥方法

小鼠給藥劑量根據公式（小鼠的劑量=9.1X mg·kg-1，X 代表成人每天服用量/60 kg）換算確定，小鼠每天灌胃體積為0.5 mL，逍遙散和氟西汀的灌胃濃度分別為0.53 g·mL-1和 0.182 mg·mL-1[9]。模型組小鼠以同體積去離子水灌胃。

1.4 試劑與儀器

本研究采用的主要試劑有：bFGF Elisa 試劑盒（CUSABIO，規格：96 T，批號：CEB-E08001m）、TGF-β1 Elisa 試 劑 盒（Multi Science，規 格 ：96T，批 號 ：EK2812）、Anti-FGF2 Anti-body（No. ab10419，abcam公司）、Anti-TGF-β1 Anti-body（No.3711，CST 公司）。主要檢測的儀器有universal Hood II 型全自動化學發光成像分析系統；power pac 1000 型電泳儀；GS-800 型分光光度計。

1.5 動物模型的建立

根據文獻報道，采用抑郁癥模型建立常用的慢性不可預知性溫和應激方法[10]造模。對各組小鼠體重、攝食量進行監測，并采用曠場試驗和糖水偏好實驗對各組小鼠行為學進行評價。自造模第1天開始于接受造模刺激前1 h灌胃。

1.6 動物一般情況和行為學檢測

1.6.1 體重測量

每日于灌胃前稱量并記錄各組小鼠體重、攝食量。

1.6.2 糖水實驗

根據文獻報道的實驗步驟[11]，實驗前，先訓練小鼠適應含糖飲用水，實驗開始時，每只小鼠預先給予一瓶1%蔗糖水和一瓶純凈水，1 h 后，取兩瓶并稱重以計算動物中糖和純水的消耗量（蔗糖偏好=蔗糖水消耗量/總耗水量× 100%）。糖水實驗于造模第21 天進行。

1.6.3 強迫游泳實驗

實驗第1天，將小鼠放入圓柱形玻璃桶中（注水高度20 cm；溫度22 ± 1℃）游泳15 min。第2 天，將小鼠放入同條件的圓柱形玻璃桶中游泳6 min，并使用視頻測量不動時間6 min。在最后5 min 內，由對設計不知情的實驗者記錄每只小鼠的不動持續時間。該實驗在造模的第21天進行。

1.7 Elisa方法檢測逍遙散對抑郁小鼠前額皮質bFGF和TGF-β1的總蛋白水平的影響

以反復凍融法裂解各組前額皮質標本，按說明書，加入標準品和待測樣本（100 mL/孔），并逐步加入抗體工作液、洗液、底物溶液和終止液，于酶標儀450 nm波長條件下檢測各孔OD 值。使用Curve Expert 1.3 軟件并求出各樣本的實際蛋白濃度。

1.8 免疫組化方法檢測逍遙散對抑郁癥小鼠前額皮質bFGF和TGF-β1蛋白免疫活性的影響

將4%多聚甲醛固定的小鼠腦組織以石蠟包埋，5 μm厚度連續切片，每個腦組織隨機挑取3 張切片進行免疫組化檢測。切片經抗原修復和內源性過氧化物酶滅活后，BSA 封閉后，滴加抗 bFGF 和 TGF-β1 兔多克隆抗體（均按1∶1000 比例稀釋）室溫條件下孵育1 小時后，滴加二抗，室溫孵育20 min，PBS浸洗，經DAB顯色，復染、脫水、透明后，以中性樹脂封片。采用Court&Measure Full cellSens 1.11系統對切片進行管擦并計算bFGF和TGF-β1陽性細胞數和OD值。

1.9 western blotting 方法檢測逍遙散對抑郁癥小鼠前額皮質bFGF和TGF-β1蛋白的表達水平的影響

BCA 法測定總蛋白濃度后，按照文獻[2]報道的western blotting 方法檢測各組小鼠前額皮質bFGF 和TGF-β1 蛋白的表達水平，并采用GIS1D 4.2 圖像分析軟件對圖像灰度值進行采集，并求出bFGF 和TGF-β1受體蛋白的相對表達量。

1.10 統計學方法

采用SPSS20.0 統計軟件對數據進行分析，以均數±標準差（）對結果進行描述。符合正態分布檢驗和組間方差齊性檢驗的數據，采用One-Way ANOVA進行統計處理，組間比較采用LSD 檢驗，以P＜0.05 作為統計學意義界限。

2 實驗結果

2.1 逍遙散對抑郁癥模型小鼠體重和攝食量的調節作用

從表1 可知，模型組小鼠體重和攝食量較正常小鼠均出現明顯的下降（P＜0.01），然而，經逍遙散和氟西汀治療后，小鼠體重（P＜ 0.05，P＜ 0.05）和攝食量（P＜ 0.01，P＜ 0.05）均出現明顯增長。

2.2 逍遙散對抑郁癥模型小鼠行為學變化的調節作用

從表2可知，與正常比較，模型組小鼠糖水偏好顯著減弱（P＜0.01），強迫游泳5 min 內不動時間顯著增加（P＜0.01）。逍遙散和氟西汀可使模型小鼠糖水偏好顯著增加（P＜ 0.01，P＜ 0.01）；使強迫游泳5 min 內不動時間顯著減少（P＜ 0.01，P＜ 0.01）。

2.3 逍遙散對抑郁癥小鼠前額皮質bFGF 和TGF-β1總蛋白含量的影響

從表3可以看出，模型小鼠前額皮質bFGF含量較正常組下降趨勢顯著（P＜0.05），而經逍遙散和氟西汀治療后，模型小鼠前額皮質bFGF 含量顯著升高（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。相反的是，模型組小鼠前額皮質TGF-β1 的含量較正常組顯著上升（P＜ 0.01），而經逍遙散和氟西汀治療后，模型小鼠前額皮質TGF-β1 的含量顯著上升（P＜ 0.01）。

表1 各組小鼠體重和攝食量變化

表2 各組小鼠糖水偏好和強迫游泳行為變化

表3 各組小鼠前額皮質bFGF和TGF-β1含量的統計學描述()/pg·mg-1

表3 各組小鼠前額皮質bFGF和TGF-β1含量的統計學描述()/pg·mg-1

注：*：與正常組比較：P ＜ 0.05，**：與正常組比較P ＜ 0.01；△：與模型組比較P ＜ 0.05，△△：與模型組比較P ＜ 0.01；

TGF-β1 9.56±0.67 16.06±2.84**11.36±1.51△△10.18±1.31△△組別正常組模型組逍遙散組氟西汀組bFGF 5.62±0.60 3.35±1.03*5.43±1.59△5.87± 0.71△△

表4 各組小鼠前額皮質bFGF和TGF-β1蛋白免疫組化OD值及陽性細胞數的統計學描述()

表4 各組小鼠前額皮質bFGF和TGF-β1蛋白免疫組化OD值及陽性細胞數的統計學描述()

注：*：與正常組比較：P ＜ 0.05，**：與正常組比較P ＜ 0.01；△：與模型組比較P ＜ 0.05，△△：與模型組比較P ＜ 0.01

陽性細胞數/n 217.42±61.65 283.92±86.31*202.75± 45.10△△195.83± 81.54△△組別正常組模型組逍遙散組氟西汀組bFGF OD值2.76±0.66 1.75±0.55**2.50± 0.53△△2.29±0.66△陽性細胞數/n 268.53±66.32 179.00±43.80**226.17±39.22△220.92±44.58△TGF-β1 OD值1.59±0.52 2.90±0.48**1.88± 0.53△△1.78± 0.43△△

2.4 逍遙散對抑郁模型小鼠前額皮質bFGF和TGF-β1的蛋白表達的影響

2.4.1 免疫組化技術檢測結果

圖2 各組小鼠前額皮質TGF-β1蛋白免疫組化檢測結果

表5 各組小鼠前額皮質bFGF和TGF-β1蛋白表達的統計學描述（）

表5 各組小鼠前額皮質bFGF和TGF-β1蛋白表達的統計學描述（）

注：*：與正常組比較：P ＜ 0.05，**：與正常組比較P ＜ 0.01；△：與模型組比較P ＜ 0.05，△△：與模型組比較P ＜ 0.01

TGF-β1 1.40±0.32 2.32±0.92**1.49±0.19△1.36±0.13△△組別正常組模型組逍遙散組氟西汀組bFGF 1.63±0.30 0.90±0.36**1.46±0.44△1.46±0.45△

從表4 和圖1 可見，模型組小鼠前額皮質bFGF 蛋白陽性細胞數和OD 值與正常組比較顯著減少（P＜0.01），與模型組比較，逍遙散和氟西汀治療組小鼠前額皮質bFGF 蛋白陽性細胞數和OD 值顯著增加（P＜0.05，P＜ 0.01）。從表4和圖2可見模型組小鼠TGF-β1蛋白OD 值和陽性細胞數較正常組顯著增加（P＜0.05），經逍遙散和氟西汀治療后，小鼠 TGF-β1 蛋白OD值和陽性細胞數顯著降低（P＜0.01）。

2.4.2 Western blot技術檢測結果

圖3 各組小鼠前額皮質TGF-β1蛋白表達情況

圖4 各組小鼠前額皮質bFGF蛋白表達情況

從表5 和圖3-4 可知，模型組小鼠前額皮質bFGF蛋白表達量較正常小鼠顯著減少（P＜0.01），而經逍遙散和氟西汀治療后bFGF 表達顯著升高（P＜0.05）。而各組小鼠TGF-β1 的表達情況與bFGF 相反，組間差異顯著（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。

3 討論

抑郁癥的發生與慢性應激密切相關。不良應激會產生多種有害物質，從而引起機體一系列應激癥狀，如消極、適應能力低下、泄瀉、體重降低、飲食減少等[12]。機體在應激狀態下，可通過各種代償機制應對，并引起一系列神經生化、內分泌和免疫等系統的穩態改變，其中參與應激反應的腦區主要有海馬、下丘腦、前額皮質、杏仁核、紋狀體等，其中前額皮質和海馬是應激反應過程中承受刺激最大、受損最嚴重的腦區[13]。

本研究結果顯示21 天慢性不可預知性溫和應激可使小鼠體重、攝食量減少，糖水偏好減少，強迫游泳5 min 內不動時間增加，且逍遙散對模型小鼠出現體重、攝食量、行為學等的變化有顯著的治療作用，以上研究結果與同類研究結果[14]相吻合，說明慢性不可預知性溫和應激可使小鼠出現明顯抑郁癥狀。

bFGF 是成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor，FGF）家族中組成成員之一，是神經膠質細胞和雪旺細胞的促有絲分裂原，能促進細胞增殖，另外bFGF 作為一種天然的神經保護因子，有維持神經細胞存活的功效[15]。有文獻報道，外源性的bFGF可改善大鼠空間學習記憶能力，小鼠接受急性應激后，前皮層中bFGF的表達明顯上調[16]。本研究觀察到，抑郁癥模型小鼠前額皮質bFGF 蛋白表達顯著上升，而經逍遙散和氟西汀治療bFGF 表達下調。表明抑郁癥小鼠自發行為和空間記憶功能的改變與bFGF 在前額皮質表達變化密切相關，且逍遙散和氟西汀對此改變有一定的扭轉作用。

轉化生長因子（TGF-β1）不僅在炎癥反應、免疫反應和組織損傷中發揮著重要作用，還能發揮對神經系統的保護作用，研究表明在抑郁癥發生中，TGF-β1 具有調節行為的作用[17]，且在CUMS 大鼠模型海馬組織內檢測到TGF-β1 的表達顯著升高，硒蛋白P 表達下降，且正常和CUMS 大鼠注射外源性TGF-β1 能明顯抑制硒蛋白 P 的表達，表明 TGF-β1 通過 TGF-β1 型受體抑制硒蛋白P 表達可能是導致抑郁發生的途徑之一[18]。本研究觀察到，抑郁癥模型小鼠，前額皮質TGF-β1 蛋白表達顯著增加，經逍遙散和氟西汀治療后均下調，表明TGF-β1 蛋白在抑郁癥發生中扮演著重要的角色。

另外，本研究團隊前期研究顯示AST 功能損害與抑郁癥的發生密切相關，且逍遙散可能通過調節抑郁癥AST 功能而發揮其治療作用[4]。而本研究觀察到逍遙散可通過調控AST 抑制劑TGF-β1 和促活化劑bFGF 而發揮治療抑郁癥的作用，其機制可能與逍遙散通過bFGF/TGF-β1 調控前額皮質AST 功能有關，但具體機制仍需進一步深入研究。