傳統膏方的長期穩定性試驗研究

梁欣健 姜倩娥 孔燕興 王葉茗▲ 周健文

1.廣州市中西醫結合醫院，廣東廣州 510801；2.廣州市天河區中醫醫院，廣東廣州 510665；3.廣東在田藥業有限公司，廣東清遠 511517

膏方是中醫的一種傳統用藥劑型，是采用中藥飲片加水煎煮，經濃縮收膏等工藝制作而成的稠糊、半流狀固體[1]，其應用是在中醫藥基礎理論的指導下，遵循個體化用藥、一人一方、辨證論治、隨證加減原則，具有滋補強身、抗衰延年、防病治病等多種作用[2]，在臨床診療及日常養生保健中的應用十分廣泛。

目前國內有開展膏方診療服務的醫療機構，其患者膏方的制作主要有兩種方式：一是由各醫療機構膏方室自行組織安排生產制作，二是委托藥廠代為加工制作。因此，各單位制作的中藥膏方其質量參差不齊。但目前國內仍然未見關于中醫膏方的“國家標準”，僅有中華中醫藥學會發布的《中醫養生保健技術規范——膏方》、以及上海中藥行業協會發布的《定制膏方加工管理規范》和《定制膏方加工管理細則》等行業規范，因此全國大部分地區的膏方只能按照《中國藥典》（2015年版）四部通則0183項“煎膏劑”的標準執行。

穩定性研究是藥品質量控制研究的重要組成部分，它直接影響著藥品的質量、臨床用藥的有效性和安全性[3]，而近年國內學者對膏方質量標準的研究大部分集中于薄層鑒定、含量測定等項目[4-5]進行研究，但對于中醫膏方的穩定性如何？一般服用的保質期為多久？按照《中國藥典》（2015年版）的微生物限度檢查法進行檢查是否可行？仍然有待進一步研究和考察。為此，筆者對傳統膏方的長期穩定性進行研究，現將有關結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器

Sartorius BS 110S電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；SH-系列鼓風干燥箱（上杭儀器有限公司）；SW-CJ系列潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；HPX-9162 MBE數顯電熱培養箱（上海海迅實業有限公司醫療設備廠）；ZRH-150B生化培養箱（廣東省醫療器械廠）；LRH-150-M霉菌培養箱（廣東省醫療器械廠）；立式壓力蒸汽滅菌器 （上海博迅實業有限公司醫療設備廠 ）；KQ-100DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（北京永光明醫療儀器廠）；SC69-02型水分快速測定儀（上海平平儀器廠）；PYX-DHS-35電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械廠）。

1.2 試藥

益母阿膠膏（由廣州市中西醫結合醫院膏方室提供，批號：171101，171102，171103）金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]，枯 草 芽 孢 桿 菌[CMCC（B）63501]，白 色 念 珠 菌[CMCC（B）98001]，黑 曲 霉[CMCC（B）98003]，大 腸 埃 希 菌[CMCC（B）44102]（均購自中國藥品生物制品檢定研究院），胰酪大豆胨瓊脂培養基（20160621），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（20160224），麥康凱液體培養基（20150820），麥康凱瓊脂培養基（20151123），無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（20160316）（均購自青島海博生物技術有限公司），聚山梨酯-80（20160503，購自湖南爾康制藥有限公司）。

1.3 方法

由于傳統膏方的制作是采用一人一方的形式，其藥物組成并不固定，難以制定一個相對穩定的指標，對其化學成分等進行定性或定量測定，因此在本實驗的長期穩定性研究中，以廣州市中西醫結合醫院產科和婦科常用的傳統中醫特色膏方基本方（處方由益母草、當歸、川芎、桃仁、炮姜等組成），采用銅鍋煎煮，明火加熱的傳統制作方法制成的益母阿膠膏作為模型藥物，在常規傳統膏方的儲存條件下（陶瓷容器密封包裝、冰箱2～8℃條件下儲存），分別考察其在0、1、2、3、6、12個月的水分含量、相對密度及微生物含量。

1.3.1 微生物限度檢查方法學驗證

1.3.1.1 菌液的制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌和枯草芽孢桿菌至胰酪大豆胨液體培養基，30～35℃培養18～24h，接種白色念珠菌至沙氏葡萄糖瓊脂培養基，20～25℃培養2～3d，接種黑曲霉至沙氏葡萄糖瓊脂培養基，20～25℃培養5～7 d。

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養物，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養物加入3～5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯-80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子菌液至滅菌試管內，制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

1.3.1.2 供試液的制備 取供試品10g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作稀釋劑至100mL，用勻漿儀混勻，制成1∶10的儲備液；再取10mL的儲備液，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100mL，搖勻，制成1∶100的供試品溶液。

1.3.1.3 需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數計數方法驗證（平皿法）

1.3.1.3.1 試驗組 取1mL供試液，在供試液中分別加入銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液或白色念珠菌和黑曲霉菌菌液小于100cfu，混勻，加入相應培養基，培養，計數。

1.3.1.3.2 菌液組 取小于100cfu的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液或白色念珠菌和黑曲霉菌菌液，注皿，培養，計數。

1.3.1.3.3 供試品對照組 取供試液1mL注入平皿，加入相應培養基，培養，計數。

1.3.1.3.4 培養條件 進行需氧菌總數計數方法適用性試驗時，使用胰酪大豆胨瓊脂培養基，培養溫度為32℃，培養時間為3d。

進行霉菌及酵母菌總數計數方法適用性試驗時，使用沙氏葡萄糖瓊脂培養基，培養溫度為22℃，培養時間為5d。

1.3.1.3.5 回收率計算公式 試驗組回收率=（ 試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）/菌液組菌落數。

1.3.1.4 控制菌檢查方法驗證 由于益母阿膠膏的藥材原料不含動物臟器，因此在控制菌檢查中只需要檢查大腸埃希菌一項。

1.3.1.4.1 試驗組 取1∶10供試液10mL加入到100mL胰酪大豆胨液體培養基中，搖勻，加入80cfu的大腸埃希菌，于35℃培養18～24h后，取預培養物1mL接種至100mL麥康凱液體培養基中，于42～44℃培養24～48h。再取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板中，按照30 ～ 35℃培養18 ～ 72h后檢查。

1.3.1.4.2 供試品對照組 除不加試驗菌液外，其余按1.3.1.4.1項同法進行檢查。

1.3.1.4.3 菌液組 直接取菌液，按2.1.4.1項同法進行檢查。

表1 益母阿膠膏的需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數計數方法驗證的平均回收率（%）

表2 益母阿膠膏的控制菌檢查方法驗證結果

表3 益母阿膠膏的微生物限度檢查結果

表4 益母阿膠膏的水分含量及相對密度測定結果

1.3.2 微生物限度檢查 取益母阿膠膏三批，按照上述已建立的微生物限度檢查方法，分別于第0，1，2，3，6，12月最后一天時取樣，按照《中國藥典》（2015年版）四部通則的1105項及1106項下[6]的微生物限度檢查法進行微生物限度檢查。

1.3.3 水分檢查 取益母阿膠膏三批，按照《中國藥典》（2015年版）四部通則0832項[6]有關水分的測定方法，采用烘干法分別于第0，1，2，3，6，12月最后一天時取樣，進行水分含量測定。

1.3.4 相對密度檢查 取益母阿膠膏三批，按照《中國藥典》（2015年版）四部通則0601項[6]有關相對密度的檢查方法，采用比重瓶法分別于第0，1，2，3，6，12月最后一天時取樣，進行相對密度測定。

2 結果

2.1 微生物限度檢查方法學驗證結果

需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數計數方法適應性驗證結果見表1，控制菌檢查方法適應性驗證結果見表2。由結果可知，需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數的平均回收率均大于70%，說明采用1∶100的稀釋法可以去除益母阿膠膏的抑菌能力，采用稀釋法聯合平皿法作為微生物限度的檢查方法是可行的。而建立的控制菌檢查方法結果呈陽性，說明該方法也是可行的。

2.2 益母阿膠膏的長期穩定性實驗結果

益母阿膠膏的微生物限度、相對密度、水分含量的檢查結果見表3～4。由結果可知，在12個月內，益母阿膠膏的微生物含量均符合《中國藥典》（2015年版）的有關要求，而其水分含量和相對密度在12個月內的變化浮動均小于5%，說明其水分含量和相對密度質量情況穩定。

3 討論

本實驗的基本方組成中含有的當歸[7]、川芎[8]、桃仁[9]、益母草[10]、炮姜[11-12]等中藥均有抑菌性，藥物中若污染的微生物，在上述具有抑菌性中藥的影響下，常規的微生物限量檢查法下有可能出現陰性結果，但是隨著時間的推移，當藥物中的抑菌成分消除后或濃度降低時，這些微生物便可復蘇并繁殖，影響藥品質量[13-14]。因此本實驗采用常規法進行需氧菌總數檢查和控制菌總數檢查時，需要先去除藥物中的抗菌活性。一般來說，中藥制劑采用稀釋法和薄膜過濾法以消除其抑菌活性[15]，項目組曾采用稀釋法（1∶20，1∶50，1∶100）3個稀釋級進行考察，結果發現1：100稀釋級的回收率可達到50%～200%，可消除其抑菌活性。

長期以來膏方一直在江浙地區流行，并且服用時基本集中在冬季進補，在嶺南地區則難以推廣，其主要原因是在于氣候問題。因為傳統膏方富含糖類等營養成分，并且不添加任何防腐劑，在全國大部分地區的夏季，以及在氣候長年炎熱潮濕的嶺南地區，膏方均難以保存。隨著現代科技的發展，冰箱的出現解決了膏方儲存的難題，使得膏方這一傳統中醫劑型得以煥發新活力，在全國推廣使用。

而傳統中醫膏方的制作方法是采用銅鍋，直接以明火加熱，歷經煎煮、濃縮、收膏、凉膏等多個步驟制作而成。由于現代制藥車間對于動用明火有嚴格的規定，必須要有相應的安全配套設施，符合消防安全的有關規定，因此國內大部分制藥企業的GMP車間和醫療機構的GPP車間，基本上都不會采用傳統的方法制作中醫膏方，所以國內采用傳統方法制作膏方的醫療機構，其膏方制作室基本上都是非潔凈車間，因此考察其質量的長期穩定性，從而判斷其安全性就顯得尤為重要。

本實驗結果表明，在常規傳統膏方的儲存條件下（陶瓷容器密封包裝、冰箱2～8℃條件下儲存），在12個月內其水分含量、相對密度及微生物含量均符合《中國藥典》（2015年版）的有關規定，并且質量情況穩定。進一步探究傳統膏方能夠通過長期穩定性試驗的原因，與其制作工藝、物質狀態、產品包裝都密切相關。從制作工藝來說，明火直接煎煮濃縮直至收膏的工藝，長時間的高溫沸騰狀態可殺滅多種病原微生物；從物質狀態來說，膏方其實是一種高度濃縮的半固體狀制劑，即膏體處于高滲狀態，再加上儲存于2～8℃的條件下，微生物的繁殖受到抑制[16]，難以生長；從產品包裝來看，選用密封性能好的容器在消毒滅菌后盛裝膏方，也有助膏方的質量保持穩定。