70株臨床分離腸球菌的毒力基因檢測與耐藥性分析

白耀霞 任建元

重慶市渝東衛生學校，重慶 408300

腸球菌是一種常見的條件致病菌，可引起人類多種傳染病。近年來，腸球菌導致的院內感染及死亡率明顯增加[1]，因此要對其引起的感染給予足夠的重視。本研究收集臨床感染的腸球菌，檢測分離菌株的毒力基因及分離株對常用抗生素的耐藥情況，然后分析腸球菌毒力基因與耐藥性二者之間的相關性，旨在為腸球菌臨床感染抗菌藥物治療提供重要指導，為腸球菌致病機制的進一步研究奠定基礎。

表1 本研究所用引物

1 資料與方法

1.1 一般資料

試驗菌株（70株非重復腸球菌）由蘇州大學第一附屬醫院惠贈，分離自蘇州大學第一附屬醫院2014年3月～2018年7月的臨床標本。菌株均已經法國Bio-Merieux公司vitek 2 Compact 60生化鑒定或法國Bio-Merieux公司vitek MS質譜鑒定。藥敏紙片為青霉素G、萬古霉素、環丙沙星、利奈唑胺、替考拉寧、氨芐西林、慶大霉素120、四環素，部分菌株采用法國Bio-Merieux公司vitek 2 AST-GP67藥敏卡藥敏分析。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 采用紙片擴散法（K-B法）、AST-GP67陽性菌藥敏卡對分離的70株腸球菌進行藥物敏感試驗。試驗操作過程和結果判斷參考CLSI M100 《抗微生物藥物敏感性試驗的執行標準》2017年版本標準。

1.2.2 制備腸球菌DNA模板 采用水煮法制備腸球菌DNA模板：刮取血平板上新鮮培養物，加入有200μL滅菌蒸餾水的1.5mL EP 管內，混勻，100℃煮沸15min，離心機12000rpm離心5min，取出上清液，即為DNA模板。于-20℃保存。

1.2.3 毒力基因的PCR擴增 反應體系25μL。組成為：T3 Mix 21μL，上、下游引物各1μL，模板2μL；反應條件為：94℃預變性5min，94℃ 30s，退火30s（退火溫度見表1），72℃ 10s，30個循環，再72℃延伸1min。引物由重慶擎科生物有限公司合成，引物序列、產物片段大小見表1。PCR產物電泳后，根據片段大小進行判斷。

1.3 統計學方法

應用SPSS21.0軟件統計處理數據，計數資料以百分數表示，采用χ2檢驗。利用雙變量相關性分析對分離株的多種耐藥率和毒力基因數關系進行分析，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

臨床標本分離得到的70株腸球菌，其中糞腸球菌為39株，所占比例為55.71%，屎腸球菌為31株，所占比例為44.29%。

2.1 腸球菌對8種抗菌藥物的敏感性結果

對腸球菌藥敏試驗研究發現，試驗所用的8種臨床常用抗生素中，均有腸球菌耐藥菌株的出現（見表2）。腸球菌對環丙沙星、四環素、青霉素G、氨芐西林、高濃度慶大霉素的表現出較高的耐藥 率，分 別 為70.00%、60.00%、48.57%、48.57%、47.14%；檢測到萬古霉素、利奈唑胺、替考拉寧的耐藥菌株；除高濃度慶大霉素、四環素、利奈唑胺外，屎腸球菌對環丙沙星、青霉素G、氨芐西林、萬古霉素、替考拉寧的耐藥率分別為90.32%、87.10%、87.10%、16.13%、12.90%，明顯高于糞腸球菌（P＜0.05）。

表2 糞腸球菌和屎腸球菌的耐藥率

表3 分離菌株的毒力基因分布

2.2 PCR擴增9對毒力基因結果

PCR擴增分別檢測每株腸球菌9個毒力基因的攜帶情況，如圖1為1株屎腸球菌（編號為607）攜帶9個毒力基因的情況。如圖1所示：ace、cpd、asa-I、esp、cyIL-A、cyIL-S、cyIL-L檢測結果為陽性，gelE、acm檢測結果為陰性。統計每個菌株的PCR結果（見表3）。結果顯示，70株腸球菌對cylL-L、cylL-S、cylL-A、ace、asa-I、acm、cpd、esp、gelE 9個毒力基因的攜帶率最高的是esp（61.43%），其次是acm（47.14%）；糞腸球菌和屎腸球菌對cylL-L、cylL-S、cylL-A、ace、cpd、gelE的攜帶率均為糞腸球菌高于屎腸球菌，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 菌株Efa607毒力基因PCR擴增產物電泳圖上樣順序：

分別研究糞腸球菌與屎腸球菌的耐藥性與所攜帶毒力基因的相關性，結果顯示：糞腸球菌和屎腸球菌的毒力基因與耐藥性之間無相關性（P＞0.05）。

3 討論

近年來，腸球菌的多重耐藥性為醫院感染治療帶來重重困難。世界衛生組織報道，萬古霉素耐藥腸球菌VRE（Vancomycin Resistant Enterococci）比例在近四年內呈顯著升高趨勢[2]。腸球菌感染已為全球感染控制帶來嚴峻挑戰。

本研究初步探索了蘇州大學附屬第一醫院2014年3月～2018年7月腸球菌的菌株流行、耐藥變遷及毒力基因分布情況。所用70株腸球菌來自門診與住院患者不同感染類型。總體而言，糞腸球菌所占比例較屎腸球菌略高；糞腸球菌攜帶的毒力基因更多，而屎腸球菌對抗菌藥物的耐藥性更強，表現出的耐藥問題更為突出。這與國內文獻報道相似[3-4]。

從藥敏試驗結果來看，出現了5株對萬古霉素耐藥的屎腸球菌，這與本區域四年前的報道有所不同[4]。同時，這5株屎腸球菌對青霉素、環丙沙星、氨芐西林及高濃度慶大霉素均表現為耐藥，而對利奈唑胺均表現為敏感，為此建議臨床嚴格控制萬古霉素的適應證，防止和減慢VRE的產生與傳播。此外，分離菌株中糞腸球菌的耐藥性與屎腸球菌存在差異，屎腸球菌對環丙沙星、青霉素G、氨芐西林顯示出很高的耐藥率，分別為90.32%、87.10%、87.10%；除高濃度慶大霉素和四環素外，屎腸球菌對其他7種抗菌藥物的耐藥率明顯高于糞腸球菌，差異有統計學意義（P＜0.05），這為臨床科學合理選用抗生素提供指導。

由位于致病島區域的溶血素基因cylL-L、cylL-A及cylL-S等編碼的溶細胞素Cyl（cytolysin）是一種細菌外毒素。它通過溶解宿主的巨噬細胞和中性粒細胞而產生免疫逃逸[5]。有研究報道：cyl陽性的糞腸球菌對環丙沙星的耐藥率明顯高于cyl陰性的糞腸球菌[6]。Miyazakis等發現：cyl陽性的糞腸球菌對萬古霉素敏感性明顯高于cyl陰性的糞腸球菌[7]。這提示cyl的存在可能與糞腸球菌對萬古霉素敏感有關。Miyazakis等及國內報道稱：糞腸球菌cyl的陽性率明顯高于屎腸球菌。本研究結果與其一致[2，7]。

糞腸球菌信息素誘導的質粒在液體培養基中的高頻率轉移與聚集物質的形成有關；聚集物質Asa1（Aggregation factor）由質粒編碼的聚集體AS和由染色體編碼的表面組分BS相互作用產生[6]。asa-I編碼聚集體AS參與細胞之間的粘附作用而使致病質粒發生轉移或感染[8]。Baylan等研究表明：asa-I和esp為尿路感染攜帶率最高的基因（陽性率分別為26.7%、25.6%），且發現asa-I陽性的糞腸球菌對環丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星的耐藥率高于asa-I陰性的分離株[9]。本研究結果顯示糞腸球菌該基因攜帶率明顯高于屎腸球菌，與國外報道結果一致[10]。

研究表明，表面蛋白Esp（Enterococci surface protein）與腸球菌在宿主細胞內定植及延長腸球菌在膀胱內的停留時間有關[10]。屎腸球菌膠原蛋白黏附素Acm（adhesin of collagen from E.faecium）是由acm基因表達的一種能夠黏附在細胞壁上的黏蛋白，其黏附能力的高低被認為與屎腸球菌的臨床感染能力密切相關[11]。在本研究中esp的陽性率最高，占61.42%，acm次之，占47.14%。這與國外報道結果一致[6]。Mete等研究發現esp在對萬古霉素耐藥的屎腸球菌中陽性率為24%，而在對萬古霉素耐藥的糞腸球菌中未檢測到該基因[8]。

膠原蛋白粘附素Ace（Adhesin to collagen from Enterococci faecalis）介導腸球菌的表面黏附。ace位于腸球菌染色體上。本研究中，糞腸球菌ace的陽性率高達69.23%，而在屎腸球菌中該基因的攜帶率僅為3.23%，差異有統計學意義。這與國外類似報道結果一致[15]。近年ace的研究備受關注，報道顯示：ace的表達受雙組分系統GrvR（EtaRS）和轉錄調節因子PrfA的重要調控，利用ace缺失突變體和互補株研究表明ace與糞腸球菌的毒力有密切關系[12-13]；Ace單抗在腸球菌感染的大鼠心內膜炎模型中，可降低糞腸球菌主動脈瓣感染[14]。

腸球菌明膠酶gelE（gelatinase）可以降解宿主細胞的膠原蛋白或組織蛋白，其降解機制與腸球菌或其致病因子向周圍擴散感染有關[16]。文獻報道gelE陽性率在19.6%到80.4%之間[17-19]。在本研究中，gelE基因陽性率為35.71%。國外研究報道糞腸球菌gelE基因陽性者對氨芐西林的抗性明顯高于不含這些基因的菌株，與不攜帶該基因的分離株相比，糞腸球菌gelE陽性菌株對環丙沙星、替考拉寧和萬古霉素的敏感性顯著增加[6]。毒力基因cpd編碼的腸球菌信息素是一種能夠與供體菌發生結合而表達聚集物質的脂蛋白[20]。經PCR檢測顯示cpd攜帶率糞腸球菌相對屎腸球菌較低，這與國外一些報道結果一致[21-22]。

綜上所述，由于腸球菌具有多種毒力因子及其細胞壁比較堅硬等特點，所以在醫院感染中比較常見。本研究藥敏試驗結果顯示：糞腸球菌和屎腸球菌對常用抗生素具有不同的耐藥率，屎腸球菌對抗菌藥物的耐藥性更強，為臨床合理利用抗菌藥物提供了重要指導；分離出的5株耐萬古霉素腸球菌均為屎腸球菌，這說明糞腸球菌所含毒力基因對萬古霉素更敏感，提示對糞腸球菌毒力基因的研究可能成為治療耐萬古霉素腸球菌感染的關注點。毒力基因檢測發現，糞腸球菌攜帶的毒力基因更多。毒力基因攜帶與耐藥性之間相關性分析得出結論兩者無相關性，但由于目前腸球菌的感染機制尚未明確，因此還需要進一步研究。