Six1對支氣管上皮細胞間質轉化及纖維化的影響

[摘要]目的 探討Six1對人支氣管上皮細胞（16HBE）間質轉化（EMT）及纖維化的影響。方法 體外培養16HBE細胞株并分成3組，實驗組轉染Six1（NM_005982）-GV146質粒，陰性對照組轉染GV146對照質粒，空白對照組僅給予LipofectamineTM2000轉染試劑。轉染48 h后用倒置顯微鏡觀察各組細胞形態的變化;采用RT-PCR及Western blot技術檢測Six1、E-鈣黏蛋白、α肌動蛋白、波形蛋白、纖維粘連蛋白、角蛋白的mRNA和蛋白表達。結果 與陰性對照組及空白對照組比較，實驗組細胞間隙增大、形態發生梭形改變;Six1、α肌動蛋白、波形蛋白、纖維粘連蛋白的mRNA及蛋白表達增高，差異有顯著性（F=11.40～881.42，Plt;0.05）;E-鈣黏蛋白、角蛋白mRNA及蛋白表達明顯降低，差異有顯著性（F=10.71～20.37，Plt;0.05）。陰性對照組與空白對照組以上各mRNA及蛋白的表達比較差異均無統計學意義（Pgt;0.05）。結論 Six1過表達可使16HBE細胞發生EMT和纖維化改變。

[關鍵詞] Six1;上皮-間質轉化;支氣管;上皮細胞;氣道重塑;哮喘

[中圖分類號] R562.26 [文獻標志碼] A [文章編號] 2096-5532（2020）04-0399-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.083[HT]

[網絡出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200417.1000.017.html;2020-04-18 09：38

EFFECT OF SIX1 ON EPITHELIAL-MESENCHYMAL TRANSITION AND FIBROSIS IN HUMAN BRONCHIAL EPITHELIAL CELL LINE 16HBE

WANG Wenxin， YANG Zhaochuan， QU Zhenghai， WANG Chong， XU Lei， ZHANG Mengxue

（Depart-ment of Pediatrics， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of Six1 on epithelial-mesenchymal transition （EMT） and fibrosis in human bronchial epithelial cells （16HBE）.

Methods 16HBE cells were cultured in vitro and then they were divided into experimental group transfected with Six1 （NM_005982）-GV146 plasmid， negative control group transfected with GV146 control plasmid， and blank control group treated with the LipofectamineTM 2000 transfection reagent. At 48 hours after transfection， an inverted microscope was used to observe the morphological changes of cells， and RT-PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression of Six1， E-cadherin， α-smooth muscle actin （α-SMA）， vimentin， fibronectin， and keratin.ResultsCompared with the negative control group and the blank group， the experimental group showed a significant increase in intercellular space and had a spindle shape， as well as significant increases in the mRNA and protein expression of Six1， α-SMA， vimentin， and fibronectin （F=11.40-881.42，Plt;0.05） and significant reductions in the mRNA and protein expression of E-cadherin and keratin （F=10.71-20.37，Plt;0.05）. There were no significant differences in mRNA and protein expression between the negative control group and the blank control group （Pgt;0.05）.Conclusion Six1 overexpression may induce EMT and fibrosis of 16HBE cells.

[KEY WORDS] Six1; epithelial-mesenchymal transition; bronchi; epithelial cells; airway remodeling; asthma

支氣管上皮細胞間質轉化（EMT）是氣道重塑中最重要的改變之一，而氣道重塑是支氣管哮喘過程中最為特征性的病理變化之一。目前，針對支氣管哮喘的治療仍然是以吸入糖皮質激素為主的對癥治療，雖然改善了大部分哮喘病人的臨床癥狀，但不能完全阻止氣道重塑的發生和發展[1]。因此，探討支氣管哮喘病人氣道重塑的機制、探尋針對EMT發生和發展的治療方法，對有效治療支氣管哮喘具有重要意義。Six1是同源盒基因家族的成員，可特異性地調節基因表達，在正常成年人組織中不表達或者表達量很低[2]，在多種疾病中表達量增高，包括肺癌和肺纖維化[3-5]，但Six1對支氣管哮喘及EMT的作用機制尚不清晰。本實驗探討Six1對支氣管上皮細胞及氣道重塑的影響，為今后更有效地防治哮喘氣道重塑提供新的分子靶點和理論基礎。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及來源

人支氣管上皮細胞（16HBE，中國醫學科學院腫瘤細胞庫）;Six1（NM_005982）-GV146過表達質粒甘油菌（吉凱公司）;質粒抽提試劑盒（TIANGEN公司）;GAPDH、Six1、E-鈣黏蛋白、波形蛋白、α-肌動蛋白、纖維粘連蛋白、角蛋白引物（北京睿博興科生物技術有限公司）;角蛋白、E-鈣黏蛋白、纖維粘連蛋白、α-肌動蛋白、GAPDH一抗（CST公司），Six1抗體（Affinity公司），波形蛋白一抗（Elabscience公司）;抗兔二抗、抗鼠二抗（Elabscience公司）;胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養基、胰蛋白酶EDTA消化液、二甲基亞砜（美國Sigma公司）;TB GreenPremix Ex TaqTMⅡ（RR820A）以及RNAiso Plus、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （RR047A）（Takara公司）。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天生物公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 質粒擴增及抽提 將攜帶綠色熒光蛋白的Six1（NM_005982）-GV146過表達質粒及GV146對照質粒甘油菌以1∶300接種至含卡那霉素的LB培養基溶液中，置于培養箱中以37 ℃、250 r/min振蕩過夜培養12 h。按照質粒抽提試劑盒說明書進行質粒的抽提。對抽提后的質粒測定純度并保存于-20 ℃的冰箱中備用。

1.2.2 分組及轉染 轉染前1 d取生長至對數期的16HBE細胞，接種于12孔板，待細胞融合至90%時，將細胞分為以下3組。①實驗組（A組）：轉染重組的Six1-GV146質粒;②陰性對照組（B組）：轉染GV146對照質粒;③空白對照組（C組）：僅給予LipofectamineTM2000轉染試劑。轉染24 h后熒光顯微鏡觀察細胞形態及轉染效率。選取轉染效率達50%以上的細胞株進行后續實驗。

1.2.3 RT-PCR檢測 將3組細胞培養48 h后，用RNAiso Plus提取細胞總RNA，并測定RNA濃度和純度。然后按照反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書將RNA反轉錄獲得相應的cDNA，并用RT-PCR方法檢測細胞內的Six1及E-鈣黏蛋白、纖維粘連蛋白、波形蛋白、α-肌動蛋白、角蛋白的mRNA表達水平，其內參為GAPDH，擴增引物及其序列見表1。使用TB GreenPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行RT-PCR擴增。記錄各組樣本擴增CT值，采用2-ΔΔCT的方法計算各基因的相對表達量。

1.2.4 Western blot檢測 將各組細胞培養48 h后，用預冷的RIPA細胞裂解液進行裂解（RIPA∶PMSF=100∶1），離心后取上清。使用BCA法檢測蛋白濃度。將蛋白轉印至PVDF膜，50 g/L奶粉封閉1 h，將封閉后的PVDF膜分別置于相應的一抗孵育液中，4 ℃搖床孵育過夜。加入二抗，室溫孵育60 min后，滴加ECL顯影劑于顯影儀中曝光顯影。用Image J軟件計算各組蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為對照分析各蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，計量資料數據以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 16HBE細胞中Six1轉染情況

轉染24 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察到帶有綠色熒光蛋白的質粒成功轉至細胞中。見圖1。轉染48 h后，RT-PCR及Western blot檢測顯示，與空白對照組和陰性對照組比較，實驗組16HBE細胞中Six1 mRNA及蛋白表達水平明顯增高，差異有顯著意義（F=881.42、78.38，Plt;0.01），而陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義（t=0.53、0.05，Pgt;0.05）。結果表明，Six1轉染至16HBE細胞并表達。見表2和圖2。

2.2 Six1對16HBE細胞形態的影響

倒置顯微鏡觀察顯示，陰性對照組與空白對照組16HBE細胞為鵝卵石樣單層細胞，細胞間連接緊密，且兩組間細胞形態無明顯差異;與空白對照組和陰性對照組比較，實驗組細胞拉長呈梭形改變，細胞間連接不緊密，細胞間隙增大。提示上調Six1的表達可使16HBE上皮細胞出現間質細胞形態改變。見圖3。

2.3 Six1對16HBE細胞EMT相關蛋白mRNA及蛋白表達的影響

與陰性對照組及空白對照組比較，實驗組E-鈣黏蛋白、角蛋白的mRNA和蛋白表達明顯降低，差異有顯著性（F=10.71～20.37，Plt;0.05）;而α肌動蛋白、波形蛋白的mRNA及蛋白表達明顯增高，差異有顯著性（F=11.40～73.97，Plt;0.05）。陰性對照組與空白對照組的E-鈣黏蛋白、角蛋白、α肌動蛋白、波形蛋白的mRNA及蛋白表達差異均無統計學意義（t=0.01～0.89，Pgt;0.05）。見表3和圖4。

2.4 Six1對16HBE細胞中纖維粘連蛋白mRNA和蛋白表達的影響

與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組纖維粘連蛋白的mRNA和蛋白表達明顯增高，差異有顯著性（F=230.00、23.26，Plt;0.01），陰性對照組與空白對照組的mRNA及蛋白表達差異均無統計學意義（t=0.38、1.15，Pgt;0.05）。見表4和圖5。

3 討 論

氣道重塑是發生在支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺纖維化等疾病中最重要的病理改變之一，也是導致哮喘病人對常規治療藥物反應性降低的主要原因之一[6]。在支氣管哮喘反復發作的過程中，呼吸道上皮細胞反復發生損傷和修復，導致氣道壁結構和功能持續改變，造成氣道重塑[7-9]。支氣管上皮細胞是呼吸系統最主要的防御屏障，除了與物理屏障、局部免疫的發生發展有關外，在某些慢性氣道疾病的病程中發揮至關重要的作用，包括支氣管哮喘的氣道重塑過程[10]。相關的研究發現，經OVA致敏的哮喘小鼠支氣管肺組織出現明顯增厚和廣泛的纖維化，且在支氣管肺泡灌洗液及支氣管肺組織中均發現Six1表達的增高，進一步抑制Six1表達后小鼠氣道炎癥和纖維化得到緩解[11]，初步證實Six1參與支氣管哮喘纖維化過程，但其對氣道重塑和纖維化作用機制尚不清楚。

Six1是近年發現的同源盒基因中的一種類型，定位于人染色體14q23上，涉及多種組織器官發育，在成年后的多種組織中無表達或表達量低于檢測限度，卻在多種疾病中過度表達[12-13]。已有大量的研究證實，Six1可以增強腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移能力，且伴隨著EMT的現象[14-16]。近年來關于Six1與呼吸道疾病的相關性研究也逐漸得到更多人的關注，結果顯示Six1的異常表達與肺癌的增殖和遷移密切相關，在肺癌組織中Six1促進了癌周及癌內的淋巴管形成、淋巴入侵以及肺癌細胞的遠處轉移[17]。我們前期研究結果顯示，Six1在哮喘模型小鼠中高表達[11]，推測Six1可能在哮喘氣道重塑中參與了EMT和纖維化的過程，干預Six1的表達可能會影響EMT及氣道重塑。

EMT是近年來人們提出的關于纖維化機制的新思路。在EMT過程中上皮細胞通過轉化為間充質細胞，使細胞具有了更強的侵襲性、運動性和抵抗性。上皮細胞形態從鵝卵石樣單層細胞轉變為可運動紡錘狀細胞，細胞間及細胞基質間連接的緊密程度下降，伴有上皮細胞表型標志物如ZO-1、E-鈣黏蛋白等表達下調，而間充質細胞標志物如α-肌動蛋白、波形蛋白等表達增加，基膜發生降解，細胞獲得遷移和侵襲能力，從而發生了分子重塑和表型的改變[18-20]。相關研究分別從肺纖維化病人及哮喘小鼠也檢測到肺上皮細胞可同時表達上皮細胞和間質細胞標記物，初步證實了哮喘的過程中存在EMT現象[21]。越來越多的研究表明，上皮細胞EMT在纖維化中扮演重要的角色[22]，纖維粘連蛋白是成纖維細胞的標志蛋白，氣道成纖維細胞在氣道纖維化和氣道重塑的過程具有重要作用[23]。研究發現，支氣管哮喘發生的早期就已經開始氣道重塑的過程，并伴隨著上皮細胞表現出間質細胞的特征[24]，表明支氣管EMT可能是哮喘氣道重塑發生早期的一種病理改變。本文研究探討Six1與EMT、纖維化和氣道重塑的關系。結果顯示，正常16HBE細胞中僅有少量的Six1表達，而上調Six1表達后16HBE細胞則發生了形態的改變，由鵝卵石樣向梭形轉變，細胞間隙增加，出現了間質細胞的形態。進一步進行mRNA和蛋白檢測表明，實驗組細胞中上皮細胞標

志物E-鈣黏蛋白、角蛋白顯著降低，而間質細胞標志物α-肌動蛋白、波形蛋白的表達均有不同程度的增加，并且在此過程中成纖維細胞標志物纖維粘連蛋白的表達也明顯升高，說明上調Six1表達可使16HBE細胞發生EMT，同時發生纖維化的改變。

綜上所述，Six1可能是造成呼吸道上皮細胞EMT、氣道壁纖維化并發生氣道重塑的原因之一，抑制Six1的表達對正常的支氣管上皮不會產生影響，但對抑制氣道重塑有一定的作用。本文結果為未來哮喘的控制和靶向治療提供了新的方向。

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（本文編輯 黃建鄉）

[收稿日期]2019-11-13; [修訂日期]2020-03-13

[基金項目]國家自然科學基金青年科學基金項目（81700029）;山東省自然科學基金項目（ZR2017MH017）;青島市民生科技計劃項目（19-6-32-nsh）

[第一作者]王文鑫（1992-），女，碩士研究生。

[通信作者]曲政海（1963-），男，碩士，教授，博士生導師。E-mail：quzhenghai@163.com。