右美托咪定對大鼠機械通氣肺損傷的作用及機制

[摘要] 目的 評價膽堿能抗炎通路（CAP）在右美托咪定（DEX）抑制大鼠機械通氣肺損傷（VILI）及VILI時NLRP3炎癥小體激活中的作用。方法 將48只SD大鼠隨機分為自主呼吸對照組（C組）、大潮氣量組（H組）、DEX組、α-7煙堿型乙酰膽堿受體拮抗劑α-銀環蛇毒素（α-BGT）組，每組12只。4組大鼠均行氣管切開插管術。C組大鼠保持自主呼吸，H組、DEX組、α-BGT組大鼠均以20 mL/kg潮氣量行機械通氣，DEX組和α-BGT組大鼠于機械通氣前1 h經頸內靜脈輸注DEX 5 μg/（kg·h），α-BGT組于輸注DEX前15 min經腹腔注射α-BGT 1 μg/kg。4 h后麻醉處死大鼠，收集血清、肺組織標本、支氣管肺泡灌洗液（BALF）。光鏡下觀察肺組織病理學改變，測定肺損傷評分及肺組織濕/干質量比（W/D）;應用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）及蛋白質免疫印跡試驗（Western Blot）分別檢測肺組織中NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）的mRNA及蛋白表達;應用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定BALF中總蛋白含量以及血清、BALF中白細胞介素（IL）-1β、IL-18的含量。結果 與C組比較，H組、DEX組、α-BGT組大鼠肺損傷評分、肺組織W/D和BALF中總蛋白含量均升高（F=3.130～8.266，t=2.270～11.900，P<0.05），肺組織內NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA及蛋白表達均上調（F=2.384～45.256，t=2.195～10.992，P<0.05），血清和BALF中IL-1β、IL-18的含量均升高（F=2.053～35.522，t=3.109～8.242，P<0.05）;與H組比較，DEX組上述各指標均降低（t=2.313～5.487，P<0.05）;與DEX組比較，α-BGT組上述各指標均升高（t=2.195～5.050，P<0.05）。結論 DEX通過抑制NLRP3炎癥小體的激活減輕大鼠VILI，其作用機制與CAP有關。

[關鍵詞] 右美托咪啶;呼吸機相關性肺損傷;膽堿能抗炎通路;炎性體;大鼠

[中圖分類號] R563.9;R971.3 "[文獻標志碼] A "[文章編號] 2096-5532（2020）06-0704-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.151 [開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200714.1410.006.html;

[ABSTRACT] Objective To investigate the role of the cholinergic anti-inflammatory pathway （CAP） in the inhibition of ventilator-induced lung injury （VILI） by dexmedetomidine （DEX） and the activation of NACHT-LRR-PYD-containing proteins 3 （NLRP3） inflammasome in rats. "Methods A total of 48 Sprague-Dawley rats were randomly divided into spontaneous brea-thing control group （group C）， large tidal volume group （group H）， DEX group （group DEX）， and α7nAChR antagonist α-BGT group （group α-BGT）， with 12 rats in each group. Tracheostomy and intubation were performed for all groups. The rats in group C maintained spontaneous breathing， and those in groups H， DEX， and α-BGT were given mechanical ventilation with a tidal vo-lume of 20 mL/kg; the rats in groups DEX and α-BGT received the infusion of DEX 5 μg/（kg·h） via the internal jugular vein at 1 h before mechanical ventilation， and those in group α-BGT were given intraperitoneal injection of α-BGT 1 μg/kg at 15 min before DEX infusion. The rats were anesthetized and sacrificed 4 h later to collect the samples of blood serum， lung tissue， bronchoalveolar lavage fluid （BALF）. Lung histopathological changes were observed under a light microscope， and lung injury score and wet/dry （W/D） ratio of lung tissue were measured. RT-PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression of NLRP3， apoptosis-associated speck-like protein （ASC）， and caspase-1 in lung tissue， and ELISA was used to measure the level of total protein in BALF and the levels of interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-18 （IL-18） in serum and BALF. "Results Compared with group C， groups H， DEX， and α-BGT had significant increases in lung injury score， W/D ratio of lung tissue， and content of total protein in BALF （F=3.130-8.266，t=2.270-11.900，Plt;0.05）， significant increases in the mRNA and protein expression of NLRP3， ASC， and caspase-1 in lung tissue （F=2.384-45.256，t=2.195-10.992，Plt;0.05）， and significant increases in the levels of IL-1β and IL-18 in serum and BALF （F=2.053-35.522，t=3.109-8.242，Plt;0.05）. Compared with group H， group DEX had significant reductions in the above indices （t=2.313-5.487，Plt;0.05）， and compared with group DEX， group α-BGT had "significant increases in the above indices （t=2.195-5.050，Plt;0.05）. "Conclusion DEX alleviates VILI in rats by inhibiting the activation of NLRP3 inflammasome， and its mechanism of action may be associated with the CAP pathway.

[KEY WORDS] dexmedetomidin; ventilator-induced lung injury; cholinergic anti-inflammatory pathway; inflammasome; rats

機械通氣肺損傷（VILI）是指機械通氣時反生理正壓通氣引起的一種肺部并發癥，其具體病因包括機械通氣時機械外力對肺泡的直接損傷，以及肺部和循環系統中炎癥通路的激活及炎性因子的釋放[1]。VILI可促進肺泡巨噬細胞中活性氧（ROS）的釋放，而ROS是NLRP3炎癥小體激活的始動因素之一[2]。NLRP3炎癥小體隸屬于核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族，由于其激活后可促進促炎癥因子白細胞介素（IL）-1β、IL-18的成熟與釋放，所以NLRP3炎癥小體在炎癥反應的發生發展中有重要作用[3]。膽堿能抗炎通路（CAP）屬于神經調控通路，通過激活巨噬細胞表面α-7煙堿型乙酰膽堿受體（α7nAChR），抑制核轉錄因子（NF）-κB的核易位，從而抑制炎性因子的釋放，發揮抗炎作用[4]。右美托咪定（DEX）是α2腎上腺素能受體激動劑，除作為麻醉鎮靜藥物外，還具有器官保護及抗炎作用[5]。研究表明，DEX可抑制NLRP3炎癥小體的激活，阻礙下游炎性因子IL-1β、IL-18的成熟與釋放，從而抑制炎癥反應，發揮肺保護作用[6]。但DEX的作用機制是否與CAP有關目前尚不明確，本研究擬評價CAP在DEX抑制大鼠VILI時NLRP3炎癥小體激活中的作用，探討其抗炎機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠48只，8周齡，體質量為240～260 g，由濟南朋悅實驗繁育有限公司提供，動物合格證號SCXK（魯）20140007。于23～26 ℃室溫、安靜環境下常規飼養1周以適應環境。采用隨機數字表法將大鼠分為自主呼吸對照組（C組）、大潮氣量組（H組）、DEX組和α7nAChR拮抗劑α-銀環蛇毒素（α-BGT）組，每組12只。

1.2 試劑及儀器

NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）及內參β-actin引物（GENEWIZ，美國），NLRP3、ASC、caspase-1、內參β-actin一抗以及山羊抗兔二抗（臺灣Arigo生物技術有限公司），Trizol總RNA提取試劑（北京天根生化科技有限公司），BCA蛋白濃度檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司），小動物呼吸機（型號：RWD 407，深圳市瑞沃德生命科技有限公司），熒光定量PCR儀（型號：ABI 7500，Applied Biosystems，美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備 4組大鼠均于實驗前8 h禁食，自由飲水，經腹腔注射30 g/L戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后行氣管切開插管術，經右側頸內靜脈建立靜脈通路。參考相關文獻的方法制備大鼠VILI模型[7]。C組大鼠保持自主呼吸;而H組、DEX組和α-BGT組大鼠均經右側頸內靜脈注射羅庫溴銨0.1 mg/kg，待大鼠自主呼吸消失后給予機械通氣。DEX組和α-BGT組大鼠于機械通氣前1 h經頸內靜脈輸注DEX 5 μg/（kg·h），C組、H組大鼠輸注等量的生理鹽水;α-BGT組大鼠于輸注DEX前15 min經腹腔注射α-BGT 1 μg/kg，C組、H組、DEX組大鼠輸注等量生理鹽水。機械通氣參數設置：潮氣量為20 mL/kg，吸呼比為1∶1，呼吸頻率為80 min-1，吸入氧體積分數（FiO2）為0.21，呼氣末正壓（PEEP）為0 kPa。機械通氣4 h后麻醉處死大鼠，收集標本。

1.3.2 標本采集 機械通氣4 h后經右側頸動脈采血5 mL，離心（4 ℃，3 000 r/min）10 min，取上清于-80 ℃保存備檢;然后麻醉處死大鼠，迅速剖出肺臟，結扎右肺，分別取右肺上葉、中葉、下葉備檢;用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）2 mL經氣管導管灌洗大鼠左肺3次，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）4～5 mL，離心（4 ℃，3 000 r/min）15 min，取上清置于-80 ℃保存備檢。

1.3.3 肺組織病理學觀察 取大鼠右肺中葉，用40 g/L多聚甲醛固定24 h，行石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察。

1.3.4 肺組織濕/干質量比（W/D）測定 取大鼠右肺上葉，用濾紙吸干表面水分，稱濕質量;然后將其放入80 ℃電熱烘干箱烘干，稱干質量。計算各組大鼠肺組織W/D。

1.3.5 肺損傷評分測定 參考文獻的方法行肺損傷評分[8]。從肺組織水腫、出血、中性粒細胞浸潤、小氣道損傷等4個方面進行評分，每項根據病變輕重評為0～4分（0分代表無病變或非常輕微病變，1分代表輕度病變，2分代表中度病變，3分代表重度病變，4分代表極重度病變），4 項累計總分即為肺損傷評分。

1.3.6 BALF中總蛋白測定 用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測大鼠BALF中總蛋白含量，操作依據說明書進行。

1.3.7 NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA 表達測定取大鼠右肺下葉部分組織，經液氮研磨后用Trizol一步法提取肺組織總RNA，操作按照說明書進行。采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法測定大鼠肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA 表達。用cDNA合成試劑盒合成cDNA，用ABI 7500型熒光定量PCR儀分別擴增NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA。RT-PCR條件：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個循環。以2-ΔΔCt（ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct值）代表目的基因mRNA表達，數據分析采用儀器自帶軟件。

1.3.8 NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達測定 采用蛋白質免疫印跡試驗（Western Blot）檢測大鼠肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達。將大鼠右肺下葉部分組織放入預冷研缽中研磨，然后加入組織細胞裂解液，于冰上靜置30 min，離心（4 ℃，12 000 r/min）15 min，取上清。取總蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，95 ℃反應10 min后行SDS-PAGE電泳，PVDF膜濕轉法轉膜（電流130 mA，電壓60 V）60 min;分別加入內參β-actin一抗（1∶5 000），NLRP3一抗（1∶1 000）、ASC一抗（1∶1 000）、caspase-1一抗（1∶1 000），4 ℃過夜，以1×TBST洗滌3次，每次10 min;加山羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫下孵育1 h，以1×TBST洗滌3次，每次10 min;采用IMAGE J軟件（NIH公司，美國）掃描蛋白條帶灰度值，用蛋白條帶灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達。

1.3.9 IL-1β和IL-18含量檢測 采用ELISA試劑盒測定大鼠血清和BALF中的IL-1β、IL-18 含量，操作依據說明書進行。

1.4 統計學分析

采用SPSS 19.0統計學軟件進行統計分析，計量數據以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 "果

2.1 各組大鼠肺組織病理學變化

光鏡下，C組大鼠肺泡結構正常、邊界清楚，無炎性細胞浸潤;H組大鼠肺泡結構破壞，肺泡壁破裂，肺間質明顯水腫，有中性粒細胞等炎性細胞浸潤;與H組比較，DEX組大鼠肺組織損傷減輕，肺泡壁相對完整，肺間質水腫程度減輕，可見少量炎性細胞浸潤;與DEX組比較，α-BGT組大鼠肺組織損傷加重，肺泡壁不連續，肺間質水腫明顯，炎性細胞浸潤增多。見圖1。

2.2 各組大鼠肺組織W/D比較

與C組比較，H組、DEX組、α-BGT組大鼠肺組織W/D均升高（F=3.130，t=3.840～7.080，P<0.05）;與H組比較，DEX組大鼠肺組織W/D降低（t=4.037，P<0.05）;與DEX組比較，α-BGT組大鼠的肺組織W/D升高（t=3.490，P<0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠肺損傷評分比較

與C組比較，H組、DEX組、α-BGT組大鼠肺損傷評分均升高（F=8.266，t=10.811～11.900，P<0.05）;與H組比較，DEX組大鼠肺損傷評分降低（t=2.959，P<0.05）;與DEX組比較，α-BGT組大鼠肺損傷評分升高（t=2.980，P<0.05）。見表1。

2.4 各組大鼠BALF中總蛋白含量比較

與C組相比較，H組、DEX組、α-BGT組大鼠BALF中總蛋白含量均升高（F=4.000，t=2.270～4.869，P<0.05）;與H組比較，DEX組大鼠BALF中總蛋白含量降低（t=2.819，P<0.05）;與DEX組比較，α-BGT組大鼠BALF中總蛋白含量升高（t=2.439，P<0.05）。見表1。

2.5 各組大鼠肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達比較

與C組比較，H組、DEX組、α-BGT組大鼠肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達均上調（F=5.444～14.878，t=4.795～10.992，P<0.05）;與H組大鼠相比較，DEX組大鼠肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達均下調（t=2.487～5.487，P<0.05）;與DEX組比較，α-BGT組大鼠肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達上調，差異具有統計學意義（t=2.195～4.527，P<0.05）。見表2。

2.6 各組大鼠肺組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達比較

與C組比較，H組、DEX組、α-BGT組大鼠肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達均上調（F=2.384～45.256，t=2.212～3.843，P<0.05）;與H組相比較，DEX組大鼠肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達均下調（t=2.313～2.370，P<0.05）;與DEX組相比較，α-BGT組大鼠肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達上調（t=2.272～2.323，P<0.05）。見表3。

2.7 各組大鼠血清和BALF中IL-1β、IL-18含量的比較

與C組相比較，H組、DEX組、α-BGT組大鼠血清和BALF中的IL-1β、IL-18含量均升高（F=2.053～35.522，t=3.109～8.242，P<0.05）;與H組比較，DEX組大鼠血清和BALF中IL-1β、IL-18含量均降低（t=3.413～5.016，P<0.05）;與DEX組比較，α-BGT組大鼠血清和BALF中IL-1β、IL-18含量均升高，差異有顯著性（t=3.608～5.050，P<0.05）。見表4。

3 討 "論

機械通氣在臨床工作中應用廣泛，在急診搶救、呼吸支持及氣道管理中均發揮不可替代的作用。其主要功能包括增加肺泡通氣量，減少呼吸肌做功，改善氧合狀態等[9]，及時有效的機械通氣對于病人的呼吸及生存至關重要。但機械通氣的并發癥，如VILI，也給病人健康造成影響，給臨床工作帶來挑戰。VILI的主要發生機制包括機械性損傷和生物性損傷，機械通氣時機械外力除直接損傷肺泡結構外，還可促進肺泡及全身循環系統中炎性因子的釋放，引發“瀑布樣”炎癥反應[10]，嚴重威脅病人健康與生命。但VILI的具體發生機制尚不明確，防治措施尚不成熟。

本實驗參考相關文獻的方法制備大鼠VILI模型[7]，結果顯示，H組大鼠光鏡下可見肺泡壁斷裂，毛細血管充血，肺間質水腫，中性粒細胞等炎性細胞浸潤;其肺損傷評分、肺組織W/D和BALF中總蛋白含量等較C組均明顯升高，證明大鼠VILI模型的制備方法正確可靠。

DEX是α2腎上腺素能受體激動劑，除用于重癥監護室病人的鎮靜鎮痛及作為麻醉輔助藥物外，還對多種器官具有保護作用，其中包括肺臟[11]。既往研究已顯示，DEX可下調晚期糖基化終末產物受體（RAGE）表達，減輕大鼠膿毒癥引起的急性肺損傷[12];可抑制IL-17表達，減弱IL-17對NF-κB信號通路的刺激，抑制炎癥反應[13];也可參與高遷移率蛋白1（HMGB1）介導的Toll樣受體4（TLR4）/NF-κB通路和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）通路，負性調控炎癥反應過程[14]。本實驗參考相關文獻[15]以及預實驗的結果，于機械通氣前1 h經頸內靜脈輸注DEX 5 μg/（kg·h）。實驗結果顯示，與H組比較，DEX組大鼠光鏡下肺泡壁破壞、肺間質水腫及炎性細胞浸潤情況減輕;肺損傷評分、肺組織W/D和BALF中總蛋白含量較C組均減低，表明DEX預處理可減輕大鼠VILI。

研究發現，DEX可通過抑制NLRP3炎癥小體的激活，減輕脂多糖誘導的急性肺損傷[6]。NLRP3炎癥小體是核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族的一員，是一種位于細胞質內的模式識別受體，在多種細胞如巨噬細胞、淋巴細胞中表達[16]。NLRP3炎癥小體是一種蛋白質復合體，主要由NLRP3、ASC和前體半胱氨酸天冬氨酸酶-1（pro-caspase-1）3部分組成[17]。機械通氣時，機械外力除對肺泡造成直接損傷外，還可以導致肺泡巨噬細胞線粒體內ROS的聚集[18]。NLRP3可以對ROS等刺激產生反應，即自身發生結構寡聚化轉變為效應結構域，效應結構域可以招募ASC。ASC是一種接頭蛋白，其主要結構包括半胱天冬酶募集域（CARD）和熱蛋白結構域（PYD），PYD可以與NLRP3的N末端相結合，CARD可以招募并結合pro-caspase-1，最終形成NLRP3炎癥小體[19-20]。NLRP3炎癥小體激活后，pro-caspase-1可轉變為成熟的caspase-1，并促進下游IL-1β、IL-18的成熟與釋放，啟動級聯式炎癥反應[21]。本文的實驗結果也顯示，H組大鼠肺組織中NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA及蛋白表達較C組均明顯上調，血清和BALF中IL-1β、IL-18的含量也較C組顯著升高，表明VILI時NLRP3炎癥小體被激活，而激活后的NLRP3炎癥小體促進了炎性因子IL-1β、IL-18的成熟與釋放，引起炎癥反應的爆發。與H組相比較，DEX組大鼠肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA及蛋白表達均下調，血清和BALF中IL-1β、IL-18的含量降低，表明DEX可抑制大鼠VILI時NLRP3炎癥小體的激活，阻礙下游炎性因子的成熟與釋放，負性調控炎癥反應。但DEX抑制NLRP3炎癥小體激活的機制尚不明確。

XIANG等[22]的研究表明，DEX可以通過激活CAP減輕系統性炎癥反應。CAP是一種通過自主神經系統調控免疫應答的調節機制，炎癥、感染或缺血等刺激均可觸發CAP[23]。研究發現，迷走神經在CAP中占據主導地位，它由70%～80%的傳入信號和20%～30%的傳出信號組成，維持多種生理機制，如免疫反應、呼吸功能等[24]。在急性炎癥過程中，迷走神經傳出信號的激活會導致交感神經激活和去甲腎上腺素的釋放，以及神經節后支配肺組織的膽堿能神經元的激活，使肺內乙酰膽堿（ACh）的濃度升高，ACh浸潤可以刺激α7nAChR炎性細胞，如巨噬細胞、中性粒細胞等，從而抑制NF-κB的活化及促炎因子的分泌，發揮抗炎作用，而α7nAChR是CAP發揮抗炎作用的最主要的膽堿受體[25]。α-BGT是α7nAChR的特異性拮抗劑，本實驗α-BGT組在給予DEX 15 min前經腹腔注射α-BGT 1 μg/kg[26]。實驗結果顯示，與DEX組比較，α-BGT組大鼠光鏡下肺泡損傷及肺組織水腫情況加重;肺損傷評分、肺組織W/D和BALF中總蛋白含量均明顯升高，表明α-BGT通過抑制CAP，抵消了DEX對大鼠VILI保護作用。同時，α-BGT組大鼠肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA及蛋白表達較DEX組均上調，血清和BALF中IL-1β、IL-18含量也較DEX組升高，表明α-BGT通過抑制CAP，消除了DEX對VILI時NLRP3炎癥小體激活的抑制作用，提示DEX抑制VILI時NLRP3炎癥小體的激活可能與CAP的激活有關。

綜上所述，DEX可通過抑制NLRP3炎癥小體的激活減輕大鼠VILI，其作用機制可能與CAP的激活有關。

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（本文編輯 馬偉平）