黔產千里光炮制前后高效液相色譜指紋圖譜及多成分含量變化

李 燕 潘炎帆 張 濤 韓忠耀

(黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558000)

千里光為菊科植物千里光(SenecioscandensBuch.-Ham)的干燥地上部分[1-2]，具有清熱解毒、明目退翳、殺蟲止癢、散瘀消腫等功效[3-4]，以及抗菌抗病毒、抗癌、消炎利膽等藥理作用，被廣泛應用于各種急性炎癥的治療[5]。其主要活性成分以總黃酮、總生物堿、金絲桃苷、綠原酸為代表。研究[6-7]表明，黔產千里光活性成分含量以8月份地上部分含量最高。目前，關于千里光的研究多以成分、藥理作用及含量測定為主，有關千里光生品指紋圖譜相關報道較少[8]，而關于千里光炮制后的指紋圖譜以及含量變化規律尚未見報道。

試驗擬以黔產千里光為研究對象，分析其炮制前后HPLC指紋圖譜，同時測定炮制前后的總黃酮、總生物堿、金絲桃苷、綠原酸含量變化規律，旨在揭示炮制對該藥的影響，為臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

千里光：自采藥材(表1)，采集時間為2018年8月，采集藥材均經黔南民族醫學高等專科學校王傳明副教授鑒定為菊科植物千里光(S.scandensBuch.Ham)全草，樣本保存于黔南民族醫學高等專科學校中藥標本館；

蘆丁對照品(批號CHB170303，純度≥98%)、苦參堿對照品(批號CHB160907，純度≥98%)、綠原酸對照品(批號CHB170713，純度≥98%)、金絲桃苷對照品(批號CHB160904，純度≥98%)：成都克洛瑪生物科技有限公司；

表1 千里光藥材采集信息表

乙腈：色譜純，重慶川東化工有限公司；

純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司；

其余試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀：Agilent1260型，美國安捷倫科技有限公司；

紫外—可見分光光度計：Cary 100型，美國安捷倫科技有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：SG-4050C型，上海碩光電子科技有限公司；

離心機：2.0R型，德國Heraeus公司；

電子天平：DV215CD型，奧豪斯儀器上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備 根據文獻[6-7]并略作修改。精密稱取蘆丁對照品和苦參堿對照品，分別置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分別為0.352 0，0.262 0 mg/mL的蘆丁對照品溶液和苦參堿對照品溶液；精密稱取綠原酸對照品和金絲桃苷對照品，置于同一50 mL容量瓶中，加入75%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液，其中綠原酸、金絲桃苷濃度分別為0.164 0，0.084 0 mg/mL。

1.2.2 炮制品及供試品溶液的制備 取地上部分于55 ℃下烘干備用，得千里光生品。取烘干后的千里光，每100 g藥材加入25 g米醋，悶潤2 h，文火炒至藥材顏色加深，取出放涼備用，得醋炙千里光。取烘干后的千里光生品、醋炙品粉末(過65目篩)約1.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇100 mL，稱定質量，回流提取1.0 h，靜置放冷再稱量，70%乙醇補足質量，搖勻，過濾，濾液于0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 根據文獻[8]并略作修改。色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為0.1%磷酸水(A)—乙腈(B)，梯度洗脫：0～5 min，2% B；6～10 min，2%～7%B；11～35 min，7.0%～16% B；36～50 min，17%～25% B；51～65 min，25%～100% B。流速1.0 mL/min，樣品進樣量20 μL，對照品進樣量5 μL，柱溫35 ℃，檢測波長327 nm，檢測時間65 min。

1.2.4 方法學考察

(1) 線性關系考察：參照文獻[6-7]。

(2) 精密度、穩定性及重復性試驗：參照文獻[9-10]。

(3) 加樣回收率試驗：取已知含量的同一樣品提取液6份，分別精密加入綠原酸、金絲桃苷標準品溶液適量進行試驗。

1.2.5 聚類分析 參照文獻[11-12]的方法，將10批千里光生品(S1～S10)和醋炙品(G1～G10)作為研究對象，采用聚類分析法，觀察不同批次藥材之間的差異性。

1.3 數據處理

利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(國家藥典委員會2004A版)，對指紋圖譜進行相似度評價。聚類分析利用SPSS 18.0軟件，采用組間連接法，選用平方Euclidean距離作為刻度，分別進行聚類。采用Excel軟件對試驗結果進行處理。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

蘆丁和苦參堿的檢測波長參照文獻[6-7]，分別選擇509，208 nm。采用二極管陣列檢測器對千里光供試品溶液進行掃描，發現327 nm下的出峰數目最多，基線相對穩定，且分離峰之間的分離效果也較好，同時綠原酸和金絲桃苷在327 nm下吸收信號較強，達到了有效分離，故最終確定檢測波長為327 nm。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察 以濃度為橫坐標，以吸光度或峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表2。

表2 線性關系考察結果

2.2.2 其他 由表3可知，36 h內儀器的精密度、方法的重復性及供試品穩定性均在3%以內，表明儀器精密度、方法的重復性及供試品36 h內的穩定性良好。

表3方法學考察試驗結果

Table3Theresultsofmethodologicalexperimental (n=6) %

名稱精密度RSD重復性RSD穩定性RSD蘆丁0.981.431.44 苦參堿0.691.261.36綠原酸 相對保留時間0.310.340.29相對峰面積1.521.691.57金絲桃苷相對保留時間0.350.410.47相對峰面積1.621.391.62

2.2.3 加樣回收率試驗 結果表明，綠原酸、金絲桃苷的平均加樣回收率分別為101.57%，99.68%，且RSD<2.08%，表明所建立的方法回收率良好。

2.3 指標性成分及參照峰的選擇

綠原酸、金絲桃苷、總黃酮、總生物堿為千里光的主要活性物質，故將其作為指標性成分。由圖1可知，綠原酸是千里光含量較高的活性成分，指紋圖譜中其峰面積較大，且保留時間為22.41 min，保留時間適中，故確定3號峰(綠原酸)為指紋圖譜的參照峰。

圖1 混合標準溶液HPLC圖

Figure 1 The HPLC chromatograms of the mixed reference substance

2.4 指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 指紋圖譜的建立 由圖2～5可知，3(S)號峰為綠原酸吸收峰，9號峰為金絲桃苷吸收峰；10批千里光生品與醋炙品指紋圖譜分別確立12，8個共有峰，其中，生品共有峰為1～12號峰(見圖4)，醋炙品共有峰為1，2，3，4，7，8，9，12號峰(見圖5)，表明醋炙顯著降低或改變了藥材成分。

由表4～7可知，生品共有峰的相對保留時間RSD<0.31，醋炙品共有峰的相對保留時間RSD<0.44，說明儀器分析條件穩定、可行，但二者共有峰的相對峰面積RSD較大，表明不同批次的生品和醋炙品成分含量均差異較大。

圖2 千里光生品HPLC指紋圖譜

Figure 2 HPLC fingerprints of rawS.scandensBuch.Ham

圖3 千里光醋炙品HPLC指紋圖譜

Figure 3 HPLC fingerprints of vinegar processedS.scandensBuch.Ham

圖4 千里光生品對照指紋圖譜

Figure 4 Control fingerprints of the rawS.scandensBuch.Ham

圖5 千里光醋炙品對照指紋圖譜

Figure 5 Control fingerprints of the vinegar processedS.scandensBuch.Ham

表4 千里光生品共有峰的相對保留時間

表5 千里光生品共有峰的相對峰面積

表6 千里光醋炙品共有峰的相對保留時間

2.4.2 相似度評價 由表8～9可知，生品與其對照圖譜的相似度為0.990～0.999，醋炙品與其對照圖譜相似度為0.818～0.997，表明除醋炙品G1批(相似度為0.818)外，10批千里光生品與醋炙品相似度均>0.987，說明其質量相對穩定可控。

表7 千里光醋炙品共有峰的相對峰面積

表8 千里光生品指紋圖譜的相似度計算

表9 千里光醋炙品指紋圖譜的相似度計算

圖6 千里光生品、醋炙品聚類分析樹狀圖

2.4.3 系統聚類分析 由圖6可知，聚類分析將10批千里光生品和醋炙品均聚為2類，千里光生品中，S9單獨聚為一類，其他聚為一類；千里光醋炙品中，G3單獨聚為一類，其他聚為一類。由于生品與醋炙品共有峰數量不同，聚類分析時，不建議將兩者合并進行聚類分析。

2.5 多成分含量測定

由表10可知，不同采集地的千里光炮制前后各指標成分含量差異較大，醋炙千里光中各成分含量較生品均有所降低，與生品相比總黃酮含量降低了41.83%，總生物堿下降了38.97%，綠原酸下降了57.64%，金絲桃苷下降了51.28%，與指紋圖譜測定結果吻合，表明炮制前后二次代謝產物有顯著性變化。

表10千里光不同炮制品中多成分含量

Table10ThecontentofvariousconstituentsofrawandprocessedGuizhouS.scandensBuch.Ham (n=10) mg/g

樣品總黃酮總生物堿綠原酸金絲桃苷生品 72.92±1.221.36±0.896.61±0.091.95±0.25醋炙品42.42±0.410.83±0.112.80±0.090.95±0.12

3 結論

比較了10批黔產千里光炮制前后的指紋圖譜及多成分含量。結果表明，千里光中綠原酸、金絲桃苷、總黃酮及總生物堿含量與產地和采收期有關，醋炙品中綠原酸、金絲桃苷、總黃酮及總生物堿含量較生品均有明顯降低，說明醋炙對千里光多成分含量產生了不同程度的影響。試驗僅對千里光炮制前后的指紋圖譜及含量進行了初步研究，針對千里光炮制前后的藥理活性還有待進一步研究。